利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究

利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究
作者：赵梁
来源：《中国实用医药》2019年第32期
【摘要】目的分析利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题。

方法 130株结核分枝杆菌株，其中20株结核分枝杆菌株对于乙胺丁醇、异烟肼、利福平和链霉素敏感， 2株H37Rv结核杆菌株，;64株对于剂量为250 μg/ml利福平表现出耐药（R250）， 44株对于剂量为50
μg/ml利福平表现出耐药（R50），均开展DNA序列分析。

结果在108株耐利福平结核分枝杆菌中，发生rpoB基因突变92株（85.2%），250 μg/ml利福平表现出耐药（R250）耐利福平结核分枝杆菌基因突变率78.1%明显低于50 μg/ml利福平表现出耐药（R50）耐利福平结核分枝杆菌的95.5%，差异具有统计学意义（P<0.05）。

R250耐利福平结核分枝杆菌基因位置主要以531密码子为主，突变率为58.0%（29/50）;基因位置在511密码子突变率为16.0%（8/50）。

R50耐利福平结核分枝杆菌基因突变位置主要以533密码子为主，突变率为23.9%（11/42）;其次基因位置在531、562密码子，突变率均为19.0%（8/42）。

结论绝大部分对于利福平耐药的结核分枝杆菌均存在rpoB基因突变现象，而对于利福平高耐药结核分枝杆菌的rpoB基因之中，主要突变特征为531位密码子突变和多个密码子联合突变。

其对于利福平低耐药结核分枝杆菌的rpoB基因内突变位置呈现出了散在性分布现象。

【关键词】利福平;耐药结核分枝杆菌;rpoB基因;基因突变
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2019.32.108
当前在治疗结核疾病过程中，结核分枝杆菌（MTB）高耐药性问题已然成为了最近几年结核疾病控制中的重要难题，其也为结核病恶化的主要因素[1]。

利福平为一类快速杀菌剂，能够明显缩短结合疾病的治疗疗程，其在短程化疗中起到了相当重要的作用。

另有研究表明，结核分枝杆菌对于利福平耐药代表病患的治疗时间加长。

倘若在此同时，联合使用其他抗结核药物耐药，代表患者的治疗效果较差。

所以说，结核分枝杆菌对于利福平耐药机制一直是当前分枝杆菌研究的热点话题。

结合实际情况，本文全面分析利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题，现报告如下。

1 资料与方法
1. 1 一般资料选取2017年1月～2018年1月本院收治的肺结核患者痰液内分离出130株结核分枝杆菌株作为研究对象，其中有20株结核分枝杆菌株对于乙胺丁醇、异烟肼、利福平和链霉素敏感;2株H37Rv结核杆菌株;64株结核分枝杆菌株对于剂量为250 μg/ml利福平表现
出耐药（R250）;44株对于剂量为50 μg/ml利福平表现出耐药（R50）。

本实验利用改良后的罗氏法进行细菌分离、培养、鉴定以及药敏实验。

同时依照肺结核诊断细菌学规程完成各项工作。

当细菌处于含量在50 μg/ml利福平的利福平培养基中能够生长就可判定为耐药，其在250 μg/ml利福平的利福平培养基中能够生长则可视为高耐药。

本实验所利用的H37Rv结核杆菌株由省结核病控制中心参比实验室所提供。

1. 2 方法①提取DNA：利用相關方式提取好DNA之后，将其放置于-20℃环境下保存，以备使用。

②聚合酶链式反应（PCR）：下游引物（rpoB2）为：5’ACG TGA GCG TGC CGC GCT GGA3’。

上游引物（rpoB1）为：5’AGG CGA TCA CAC CGC AGA CGT3’。

所扩增的DNA片段长度均为184 bp。

实验所使用的PCR检测系统由华美公司所提供。

③DNA序列分析：实验使用VGI公司生产的自动测序仪，开展相关工作，试剂盒为配套产品。

使用浓度为6%的聚丙烯酰胺凝胶开展电泳工作，并自动识别，判定结果。

1. 3 统计学方法采用SPSS21.0统计学软件处理数据。

计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。

P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
20株（R0）对于异烟肼、利福平、乙胺丁醇和链霉素敏感的结核分枝杆菌以及2株
H37Rv结核杆菌株没有检测出rpoB基因易感区存在突变现象。

在108株耐利福平结核分枝杆菌中，发生rpoB基因突变92株（85.2%）。

其中R250耐利福平结核分枝杆菌基因突变50株（78.1%）;R50耐利福平结核分枝杆菌基因突变42株（95.5%）， R250耐利福平结核分枝杆菌基因突变率明显低于R50耐利福平结核分枝杆菌，差异具有统计学意义（P<0.05）。

R250耐利福平结核分枝杆菌基因位置主要以531密码子为主，突变率为58.0%（29/50）;基因位置在511密码子突变率为16.0%（8/50）。

R50耐利福平结核分枝杆菌基因突变位置主要以533密码子为主，突变率为23.9%（11/42）;其次基因位置在531、562密码子，突变率均为
19.0%（8/42）。

R250耐利福平结核分枝杆菌菌株基因突变内共计10株出现多密码子联合突变，在此其中涉及到511位亮氨酸共计8株（80.0%）。

3 讨论
从rpoB基因突变和利福平最低抑菌浓度关系方面来看，当前临床开展结核分枝杆菌药敏实验中[1]，一般使用绝对浓度法予以进行。

全面分析分枝杆菌是否出现耐药现象。

世界卫生组织规定细菌在含量于40～50 μg/ml利福平培养基中能够生长，可以判定为耐药。

从我国来讲，临床中判定利福平耐药。

情况一般采用两个浓度，详细为50 μg/ml以及250 μg/ml。

其分别代表了低度耐药以及高度耐药。

最低抑菌浓度（MIC）主要指的是：细菌在内含药物的培养基中无法生长最低药物浓度水平，其为判定细菌耐药水平的精准化指标[2]。

本实验对于结核分枝杆菌菌株rpoB基因突变区开展DNA序列分析，结果证实：20株对于异烟肼、
利福平、乙胺丁醇和链霉素敏感的结核分枝杆菌以及2株H37Rv结核杆菌株中没有检测出rpoB基因突变区域改变。

108株对于耐利福平低耐药和耐利福平高耐药结核分枝杆菌菌株内共计92株存在rpoB基因核心区域点突变现象，其和我国相关报道类似。

基因突变的频次和耐
药程度不存在关联性[3， 4]。

531位氨基酸突变为中国结核分枝杆菌和利福平耐药有关的最常见突变类型。

其也为高耐药结核分枝杆菌rpoB基因主要突变位点。

本实验中50株R250耐利福平结核分枝杆菌基因位置主要以531密码子为主;42株R50耐利福平结核分枝杆菌基因突变位置主要以533密码子为多，其次为531、562密码子，仅有8株内含531位密码子突变。

由此能够发现， 531位氨基酸突变位是利福平高耐药结核分枝杆菌主要突变特征。

结核分枝杆菌出现耐药性的主要方式为染色体突变所见的耐药性[5-7]。

因为把基因核苷酸出现突变，进而形成了不正确的氨基酸序列。

这在一定程度上对药物以及靶位酶亲和性造成
影响，进而形成了结核分枝杆菌对于药物敏感性耐受或下降。

细菌对利福平药物产生耐药主
要形式为点突变，而对于利福平高耐药结核分枝杆菌株之中，其更容易发生多个密码子联合突变[8， 9]。

综上所述，绝大部分对于利福平耐药的结核分枝杆菌均存在rpoB基因突变现象，而对于利福平高耐药结核分枝杆菌的rpoB基因之中，主要突变特征为531位密码子突变和多个密码子联合突变。

其对于利福平低耐药结核分枝杆菌的rpoB基因内突变位置呈现出了散在性分布现象。

参考文献
[1] 黄振宇，范学工. 210株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究. 中国人兽共患病学报， 2007， 23（6）：548-551.
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[收稿日期：2019-04-01]。