7 第七章 外源基因的表达

2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
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原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下特点：
（1）大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制， 可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
（2）基因组结构简单，便于基因操作和分析。
（3）多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于 构建相应的表达载体。
一、启动子
启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合
酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA序列。
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1. 原核生物的启动子
原核生物的启动子一般由四个部分构成：转录 起始位点、两个六联体保守序列区和间隔区。
识别区 Pribnow框 转录起点
16～19bp
5～9bp
5’ TTGACA TATAAT A（G） 3’
RNA … NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH
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N
N
N
N
C
GC
CG C G RNA结构
GC
CG
GC
AU
AU
……NNNN UUUU-OH3
图： 强终止子模式图
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三、SD序列:
mRNA的翻译起始效率主要由其5’端的结构序列 所决定，称为核糖体结合位点（RBS），它包括下列 四个特征要素：
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（3）Sextama框: 在转录启动区的另一个六联体 保守序列位于距转录起始位点上游35bp处，通常称 为-35区，该保守序列为TTGACA，其中前三个碱 基具有较强的保守性，它是RNA聚合酶的识别位点。
（4）间隔区: 原核生物启动子在转录起始位点与 Pribnow框之间、Pribnow框与Sextama框之间存在 长度不等的间隔序列。间隔序列内部无明显的保守 性，其序列的碱基组成对启动子的功能并不十分重 要, 但间隔序列的长度却是影响启动子功能的重要 因素。

外源基因在原核細胞中的表達
外源基因在原核細胞中的表達
1. Structure elements for gene expression: Gene Organization
外源基因在原核細胞中的表達
Gene Expression and Regulation Levels
Levels at which gene expression is regulated in prokaryotes
外源基因在原核細胞中的表達
• gal: gal基因表達半乳糖代謝所需的各種酶類及調節蛋白, 基因的變異 使細胞不能直接利用半乳糖作為碳源。
• dcm (DNA cytosine methylase)功能：dcm基因表達胞嘧啶甲基化酶 ，它能特異性識別DNA雙鏈上的CCWGG序列，並使第二個C甲基化 ，即CmCWGG，避免DNA受到相關限制酶的切斷。dcm基因的變異 導致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易於 獲得非甲基化質粒。
外源基因在原核細胞中的表達
Fusional Expression Vector
Factor Xa---Activated form of factor x that participates in both the intrinsic and extrinsic pathways of blood coagulation. It catalyses the conversion of prothrombin to thrombin in conjunction with other cofactors.
Structure of a typical promoter in E.coli
外源基因在原核細胞中的表達

mRNA 的翻译才能进行
ATG 与 SD 序列之间的碱基组成为 A，
T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。
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核糖体结合位点本身和附近的序列决定 了目标基因 mRNA 5’ 端的二级结构，研 究表明讨 mRNA 5’端形成的 “茎环” 结 构阻碍了 mRNA 与核糖体 30S 亚基的结 合，从而抑制了翻译的起始。
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大肠杆菌基因表达载体
6、密码子：密码子有简并性，多个 密码子为一个氨基酸进行编码，不 同生物在利用这些密码子时其利用 频率不同，不同的密码子会影响到 大肠杆菌的翻译速度。
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基因表达的机制
基因工程技术的核心是基因表达技术。 迄今为止，已构件建了不同类型的表达 系统，可根据需要合理地选择适当的表 达系统。
外源基因在受体细胞中的表达包括：
1、转录 2、翻译
两个环节
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基因表达的机制
基因工程的核心问题：有效表达 外源基因表达的关键步骤：起始转录 基因表达的限速步骤：转录起始的速率 构建表达系统时首先要考虑的问题是： 1、选择可调控的启动子 2、相关的调控序列
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在进行融合表达时，一般将受体菌 蛋白位于N端，而外源蛋白位于C端。 外源蛋白与菌体自身蛋白以融合蛋 白的方式表达后其稳定性大大增加。 其原因为：外源小分子蛋白上的酶
切位点暴露于分子的表面。当以融 合蛋白的形式表达后，外源蛋白部 分在菌体自身蛋白的引导下正确折 叠，可最大程度上封闭酶切位点。
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常见的大肠杆菌表达系统

序列修饰，pr稳定性因子 优化发酵过程：工艺 生物学：菌体生长，表达条
件，产物总量
The expression vector
Most important elements in the vector
Promoter
-35: TTGACA (E. coli ) -10: TATAAT (E. coli )
Terminator (hairpin) Ribosome binding site (RBS) Selection marker Vector replication sequence
(ori) Polylinker (MCS)
In the gene/vector
tac promoter
GAL system
Gene cloned under control of the GAL4 promoter Induction by galactose as the sole carbon source Stronger induction by PGAL1 Gal4p transcriptional activator - 1-5% of total protein - Leaky promoter
赵 子 昂
第七章 基因表达系统
外源基因表达系统 泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适受体细
胞，并在其中有效表达，产生目的基因产物 1．E. coli表达系统： 常用lac & tac：以lac操纵子调控机制为基础：lacP
lacO 结构基因（lacZ, Y, A），lacI 阻遏pr，IPTG诱 导， PL & PR：以phage溶原/溶菌循环 T7启动子：T7RNA聚合酶识别序列在pET中MCS上 端，RNA聚合酶位于BL21(DE3)基因组中，上端为 lac启动子调控，IPTG