第6章 细胞培养（3学时）
第一节 单细胞培养
第二节 细胞悬浮培养
本章小结
目的要求：
1、掌握得到单细胞无性系的技术
2、掌握细胞培养的方法，其含义及特点
3、学会小细胞团的计数方法
第一节 单细胞培养
一、单细胞的分离
1．愈伤组织诱导
不同的植物彩用不同的方法用不同的外植体诱导形成愈伤组织。愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。
2．单细胞悬浮液的制备
将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物，进而通过振荡培养，使愈伤组织形成细胞团，小细胞团甚至是单细胞分散培养物，再进一步通过细胞筛过筛得到单细胞悬液。
二、单细胞培养的方法
（一）看护培养法
指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。可诱导形成单细胞培养系。Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。
基本操作步骤为：
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。
（2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm²）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。
（3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。
（4）恒温培养。
此法简便易行，效果好，易于成功。但是不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
微室培养法
即将细胞培养在很少量的培养基中。在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。
（二）微室培养法
（1）微室内不能有气泡。
（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片 的厚度要在0.17～0.18毫米左右。
（3）观察时要保持温度和培养时的一致。
（三）平板培养法
是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。用于分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。该法的特点为：可以定点观察；分离单细胞系容易；但培养细胞气体交换不畅。平板培养的基本技术：
实验四 花粉发育时期的鉴定与花药培养
一、实验目的
花药和花粉培养中，花粉的发育时期是提高植株诱导频率的重要因素。准确
地鉴定花粉的发育时期。适时接种是花药、花粉离体培养中十分重要的操作技术。
本实验的目的是学习花粉发育时期的镜检技术，识别关键时期的细胞学特
征，同时学习花药培养的操作技术。 二、实验用具和药品
1. 实验用具：显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、超净工作台、镊子、剪刀、解剖
刀、酒精灯、培养皿等。
2. 药品试剂：醋酸-洋红液、HgCl2、70%酒精、灭菌蒸馏水、培养基用各类试剂药
品等。
三、实验材料
不同植物各发育时期的花蕾。 四、实验方法
（一）取固定液中花药一个，置于载玻片上，用吸水纸吸去固定液，滴上一滴醋
酸洋红染色液，用解剖针大头一端，在染色液中将花药轻轻压碎，目的是使花粉
从药囊中游离出来。然后弃去药壁残渣，盖上盖玻片。在酒精灯火焰上迅速来回
轻烤几次。目的是破坏染色质，促使细胞核着色，同时驱赶气泡。可随时用手背
试测温度，注意不可过热或煮沸，待制片冷却后，可在显微镜下检查。
（二）花药愈伤组织的诱导 镜检确定花粉发育时期，选取花粉处于单核中晚期
的花蕾，用0.1%氯化汞溶液整体灭菌10min，无菌水冲洗3-5次，剥取花药，接
种到5种诱导培养基上以筛选最适培养条件。
1. MS+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L
2. MS+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L
3. MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 1.0mg/L
4. B5+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L
5. B5+2,4-D 0.2mg/L+KT 1.0mg/L
（三）培养条件 黑暗条件下预培养3d,后转入正常光照条件下继续培养。在愈
伤组织转移出来之前统计花药愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率=(形成愈伤组织花药数/接种花药数)×100% 五、花粉发育时期的特征
・６６・
花药和花粉的离体培养
乐赛军 （湖北省武汉市蔡甸区第五高级中学４３０１００）
摘要花药和花粉的离体培养都可以获得单倍体，但两者 有区别。本文简要介绍花药和花粉的离体培养技术。 ， 关键词花药花粉离体培养
１发展概况
花药和花粉的离体培养，简称花培，开始于２Ｏ世
纪５０年代，Ｔｕｌｅｃｋｅ首先培养银杏的成熟花粉粒得到
愈伤组织。１９６４年Ｇｕｈａ和Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ成功用毛叶曼
陀罗花药培养获得许多胚状体，并证明胚状体直接起
源于花粉粒，最终从胚状体进一步发育得到单倍体植
株。目前至少有３４个科，８８个属，３００多种植物的花
药培养成功－ｌ Ｊ。
我国的研究始于２０世纪７０年代，将花培和传统
育种手段相结合先后培育出大批具研究和应用价值的
品种，如烟草、小麦、玉米、甜椒等ｌ 。１９７４年中科院
植物所与山东烟草研究所合作，成功培育成烟草新品
种并大面积推广，这是世界上第一个用单倍体育种方
法培养出来的新品种。我国花培及单倍体育种应用在
世界上处于领先地位【引。
２相关概念
２．１ 花药 花药是植物花的雄性器官，一般被子植物
的花药有４个花粉囊，每个花粉囊由外部的药壁和内
部的花粉组成。药壁和药隔等组织的细胞为二倍体的
体细胞，花粉是由花粉母细胞经过减数分裂形成的雄
性性细胞。
２．２花粉花药内的花粉母细胞（２ｎ）经减数分裂产
生４个一群的单倍体细胞（ｎ），这个发育时期称为四分
体。由四分体刚刚解体形成的４个单倍体细胞，即单
核花粉，又称为小孢子。小孢子继续发育，其核进行第
一次有丝分裂后形成１个精核和１个营养核的二核细
胞（二核花粉）；营养核再有丝分裂一次形成２个精核
和１个营养核的三核细胞（三核花粉），即成熟花粉。
成熟花粉是植物的雄配子体。
２．３花药培养花药培养是将花药（花粉发育到一定
阶段）接种到人工培养基上培养，以形成花粉胚或愈伤
组织，进而分化成植株的技术。
２．４ 花粉培养花粉培养是将花粉从花药中分离出
第6章 《细胞培养》复习题及参考答案
一、填空：
1、一般平板培养要求细胞密度每毫升为1x103∽100x103 个。
★2、条件培养基是悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。
★3、细胞悬浮培养主要应用于
植物有用物质的生产、诱发和筛选突变体、原生质体培养和细胞器分离、食品生产等。
4、由植物叶片分离单细胞的方法有机械法和酶解法。
★5、细胞悬浮培养方法：成批培养；连续培养
★6、连续培养的种类：(1)半连续培养；(2)连续培养
★7、连续培养的方法:（1）浊度恒定法;（2）化学恒定法
二、名词：
1、看护培养法(nurse culture)：是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
★2、平板培养法(plante culture)：是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。
★3、细胞悬浮培养（suspension culture）： 是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
4、初始植板密度（inital planting density）：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
5、临界密度(critical density)：单细胞培养时，初始植板密度低于某值培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度。（课件没有）
6、植物细胞培养（plant cell culture）：是指对植物器官或愈伤组织上分离出的单细胞（或小细胞团）进行离体培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
7、条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。
8、植板率：是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数
三、问答题：
1、如何得到单细胞无性系？
在细胞培养中，常由分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物来制备单细胞，也可以用机械法和酶解法从植物器官直接制备单细胞。
