纯化蛋白的简易步骤
纯化
1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220
rpm培养。
2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至
OD600≈0.4-0.5。
3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱
导前对照）。之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。
4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻
存）。
5.配制buffer A，如下
6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl2
1:2000）。1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。
7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。
8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。（一定不要菌体碎片！
取4ul+4ulLB 作为binding前的对照）
9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液
沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。
10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音
混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。
11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer，
放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。
Wash buffer: buffer A+20mM imidazole
12.洗好的beads加入适量（5CV）的elution buffer，放置10min后洗脱。为了确保蛋白全
部洗脱下来，可以边洗脱边用考马斯亮蓝法检测蛋白，当不再变蓝时，就不用再洗脱了。
Elution buffer：buffer A+250mM imidazole (imidazole 浓度高时，用浓HCl调pH值) 11. elution 后的蛋白分装成50-100uL/管，冻于-80℃，避免反复冻融。取5-10uL电泳检测蛋
白表达量。
蛋白浓缩步骤：
将提纯的蛋白加入浓缩管中（10），3000g，4℃，第一次离心10min（用bradford检测废液中是否有蛋白）。边离心边检测，至终体积约为700uL。用200uL枪吸出蛋白，注意不要碰到膜，检测蛋白的终浓度。
FPLC
1、用buffer A 平衡分子筛，flow rate: 0.5; pressure <1.2，时间大约1h。
2、将浓缩好的蛋白离心5min，上清用注射器加入进样孔。
3、收集峰值很好的蛋白，取出跑电泳，染色，检测是否有目的条带，纯度如何。
4、选取纯度最好的蛋白，浓缩后测量浓度，计算得率。
5、若蛋白浓度和纯度达到标准，即可进行结晶实验。
上样：
Pump flow 0.5ml/min insert
Flowpath inject
Alarm alarm pressure <1.5Mpa
Fraction size 0.5ml
End time acu volume 25ml
Execute
A 泵放水中，pump wash pump A insert
DLS（动态光散射）
判断纯化蛋白的分子量大小。
结晶蛋白
TIPS:
1、Lysis buffer 多加一点，50mL/L 菌。
2、离心时间长一点45min 10000rpm
3、5个柱体积洗beads
4、Binding 1h. Binding后先倾斜放，等beads 沉下去后把beads先吸到预装柱里，再把上
清加进去。
5、10个柱体积wash, 注意不要破坏柱床。
6、5个柱体积洗脱。一般第二次最浓，边洗脱边用Bradford检测，不变蓝就不用再洗脱
了。1ml+1ul蛋白变色？
7、浓缩<3000g（千万不要超过），一般用3500rpm 就可以了。
