鸡卵类黏蛋白的分离纯化

鸡卵类黏蛋白的分离纯化、活性及分子量测定唐灵杰杨荣燕曹雪文唐威风河北大学生命科学学院 2013生物工程2班摘要：本实验的主要目的是掌握鸡卵类黏蛋白（CHOM）的性质及活性测定方法，了解其应用。

掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握电泳仪的使用。

掌握离心机、分光光度计的使用。

鸡卵类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算类粘蛋白的活力。

先通过三氯乙酸-丙酮除去蛋清中的杂蛋白，后经等电点沉淀得到类粘蛋白的粗品；然后经过DEAE纤维素柱层析纯化得到纯品；用Folin-酚法测定粗品和纯品中蛋白质含量，紫外分光光度计测定其抑制活力；最后，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测类粘蛋白的纯度及分子量。

关键词：鸡卵类粘蛋白纯化层析抑制活力分子量Abstract:The main purpose of this experiment is to grasp the nature and activity of chicken ovomucoid CHOM, and to understand its application.. Master polyacrylamide gel electrophoresis technology, master the use of electrophoresis. Master centrifuge, spectrophotometer use.Chicken ovomucoid is a kind of specificity strong trypsin inhibitors, can hydrolyze ester keys, amides keys and peptide bond. Use this nature and synthetic substrate or natural protein can determine the vitality of trypsin, so can calculating the vitality of chicken ovomucoid.First, remove the miscellaneous protein in egg white by TCA –acetone, then get the rough protein by isoelectric precipitation.Then after chromatography column packing column, balance, Sample , elution, rebalance etc to achieve the purification of chicken ovomucoid.then we can get the eligibility product from DEAE cellulose column chromatography at last.The contents of protein in crude and pure products were determined by Folin- phenol method, and the inhibition activity was determined by ultraviolet spectrophotometry.Finally, through SDS-page polyacrylamide gel electrophoresis to determine the purity and molecular weight of chicken ovomucoid.Key words：Chicken ovomucoid Purification Chromatogram inhibitory activity molecular weight1前言鸡卵类黏蛋白（ Chicken Ovomucoid, CHOM）是从鸡卵清中分离的糖蛋白，具有强烈抑制胰蛋白酶的的作用，是典型的胰蛋白酶抑制剂，常用于胰蛋白酶及类胰蛋白酶的酶学性质研究。

CHOM在pH7.8-8.0的碱性条件下，具有很强的结合胰蛋白酶的活性，而且这种结合是可逆的，因此，可以制成亲和吸附剂，用以纯化胰蛋白酶。

鸡卵类黏蛋白为糖蛋白，在糖蛋白的糖链部分（主要是D－甘露糖、D－半乳糖、葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差别，所以，在电泳行为上常呈现不均一性，经常表现为弥散性条带。

目前至少已获得四种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶性能上及氨基酸组成上没有多大的区别。

鸡卵类黏蛋白的等电点有一定的范围：大致在pH3.9－4.5，分子量在28000Da。

其抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：1，1μg高纯度的卵类黏蛋白能抑制相当于0.86 μg的胰蛋白酶（比活力为12000BAEE U/mg）。

不同来源的卵类黏蛋白的N-末端残基有很大差异，鸡卵类黏蛋白的N-末端为Ala，C-末端为Phe。

卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的尿素很稳定，在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。

鸡卵类黏蛋白对猪、牛的胰蛋白酶强烈抑制，对枯草杆菌蛋白酶有一定程度的抑制，但对人的胰蛋白酶无明显的抑制作用，对胰凝乳蛋白酶也无抑制作用。

2材料与方法2.1 材料新鲜鸡蛋、0.05mol/L三氯乙酸溶液（TCA）、丙酮溶液、DEAE-纤维素、 0.2 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液、0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液、0.3mol氯化钠-0.02mol PH6.5磷酸盐缓冲液、0.5 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液、3.0 mL BAEE- 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液、0. 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液、0.0 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液胰蛋白酶、Folin-酚试剂：试剂甲：①4%碳酸钠溶液；②0.2mol/L氢氧化钠溶液③1%硫酸铜溶液；④2%酒石酸钾钠溶液。

先将①②等体积混合，再将③④等体积混合，再将这两种混合液按50：1的比例混合，试剂乙、 30% 胶母液、pH 8.9 Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、10% APs、pH 6.7 Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液、BSA、Marker、考马斯亮蓝染色液、脱色液。

2.2 仪器离心机、恒温水浴锅、冰箱、紫外分光光度计、电泳仪、摇床、核酸蛋白检测仪、漏斗、透析袋、离心管（1.5mL）、烧杯（250mL、500mL、1000mL）、吸量管（0.5 mL、1 mL、5 mL）、层析柱、铁架台、石英比色皿、微量进样器、十齿样品梳（厚度1mm）、细长头滴管离心管（1.5mL）、培养皿、成套玻璃板。

2.3 方法2.3.1 有机溶剂分级沉淀CHOM粗品2.3.1.1 去除杂蛋白两人一组，量取25mL新鲜鸡蛋清，盛于250mL烧杯内，烧杯置于25～30℃恒温水浴锅内，边搅拌边缓慢加入等体积4℃预冷的三氯乙酸（TCA）－丙酮溶液（1:4体积比），出现大量白色沉淀，为杂蛋白，此时溶液的pH约为6～7，保温30min。

用大约7～8 mL 0.5mol/L TCA调节至pH3.5，使杂蛋白沉淀完全，在4℃下放置1h, 4000 r/min离心20 min，轻轻将黄绿色上清液倒出，每2个人量取20mL （剩余的上清液扔掉），4个人合并为1组，共40mL，倒入250mL三角瓶中，用纸封口、贴标签放入冰箱中冷藏。

2.3.1.2 沉淀粗品4倍于上清液体积的-20℃预冷的丙酮（ 160mL ），边搅拌边加入黄绿色上清液中，可见白色沉淀产生，在4℃冰箱中放置1－2 h。

（课程安排在上午的，前一天下午沉淀，第二天上午上课时再离心）。

从冰箱中轻轻（不要将沉淀晃起！）取出三角瓶，将上清液缓慢倒出，尽量少留上清液，总体积最多不超过40mL。

两两配平，4000 r/min离心20 min，弃上清液，得CHOM沉淀，加入4mL无离子水溶解。

2.3.1.3 粗品获得透析操作需戴上一次性手套或胶皮指套，以防手上的汗液等污染透析袋。

将透析袋用无离子水煮沸10min，再用无离子水清洗干净，一端用橡皮筋绑紧，用无离子水试漏，若不漏，再将4mL 粗酶液装入透析袋，赶出透析袋中的气泡，留出约0.5cm富余，绑紧另一端，对无离子水透析，更换数次无离子水，以除去残留的TCA和丙酮，透析后可见少量沉淀（为变性蛋白），需离心去除。

透析过程至少需要2.0h，隔1h更换一次无离子水。

用滴管取出透析袋中的黏蛋白溶液（及时将透析袋用无离子水清洗干净），放入7mL离心管 8000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液倒入另一7 mL离心管，贴好标签，放入冰箱冷冻。

2.3.2 DEAE-Cellulose纯化CHOM2.3.2.2 DEAE-纤维素的处理及再生新纤维素的处理：取50g DEAE-纤维素-32或DEAE-52，用少量水溶胀1 h，用0.5mol/L氯化钠-0.5mol/L氢氧化钠溶液搅拌处理20min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L盐酸与0.5mol/L氯化钠溶液搅拌处理20 min，用大量的蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L氯化钠溶液—-0.5mol/L氢氧化钠溶液处理一次，最后用大量的蒸馏水洗至中性，放置冰箱中保存。

旧纤维素的再生：省去酸处理一步，只用0.5mol/L氯化钠溶液-0.5mol/L 氢氧化钠溶液处理一次，用大量的蒸馏水洗至中性，置4℃冰箱中保存。

2.3.2.3 装柱取一支层析柱，检查上下端的螺口，用洗耳球吹硅胶管，使之通气。

下端螺口旋紧，用水止夹紧软硅胶管。

将层析柱垂直安装在铁架台上，先加入1/3～1/2柱体积的水，在柱的上端插一合适大小的玻璃漏斗，使漏斗颈的外径与层析柱的内径吻合，以防层析柱中的水或缓冲液渗出。

将处理好的DEAE-纤维素调成浆糊状，倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度。

打开柱下端的水止，继续搅拌漏斗内的纤维素，使之沉降至3/4柱高。

计算柱体积：量测柱床的高度，柱内径为1cm，底面积乘以高位柱床体积。

将柱下端的硅胶管连接在核酸蛋白检测仪样品池的入口，打开核酸蛋白检测仪电源，将波长置于280nm处，预热至少30min，准备一个烧杯，收集样品池出口的流出液。

2.3.2.4 平衡用3倍柱体积的0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液（起始液）平衡层析柱。

始终保持柱床上边最少有2cm高度的缓冲液。