乙酰辅酶A( Acetyl-CoA)含量测定试剂盒使用说明

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断猪（Porcine）乙酰辅酶A乙酰基转移酶2（ACAT2）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被乙酰辅酶A乙酰基转移酶2（ACAT2）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的乙酰辅酶A乙酰基转移酶2（ACAT2）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性。

样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。

3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。

3000转离心10分钟取上清。

5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、250、500、1000、2000、4000U/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

游离脂肪酸测定试剂盒（ACS-ACOD法）适用范围：本产品适用于体外定量测定人血清中游离脂肪酸（NEFA）含量。

1.1 产品规格1.2主要组成成分注：校准品、质控品具有批间、赋值特异性，具体值详见靶值单。

2.1外观2.1.1试剂盒标签标识清晰，外包装完整无破损；2.1.2 试剂1：无色或淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；2.1.3 试剂2：无色或淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；2.1.4 校准品：无色或浅黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；2.1.5 质控品：无色或浅黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物。

2.2 净含量净含量不低于标示值。

2.3 空白吸光度在主波长546nm、副波长700nm、37℃条件下，试剂空白吸光度A≤0.2。

2.4 线性范围（0.05,3.00）mmol/L范围内，相关系数r≥0.990；（0.05,1.00]mmol/L范围内，绝对偏差不超过±0.10mmol/L；（1.00,3.00)mmol/L范围内，相对偏差不超过±10.0%。

2.5分析灵敏度在产品说明书规定参数设定条件下，测定浓度1.0mmol/L的样本，吸光度变化△A≥0.05。

2.6 精密度2.6.1批内重复性CV≤10.0%。

2.6.2 批间差相对极差R≤10.0%。

2.7 准确度与已上市产品比对：（0.05,3.00）mmol/L范围内，相关系数r≥0.990；（0.05,1.00]mmol/L范围内，绝对偏差不超过±0.10mmol/L；（1.00,3.00)mmol/L范围内，相对偏差不超过±10.0%。

2.8 校准品2.8.1 均一性CV≤5.0%2.8.2 开瓶稳定性：开瓶后3天，相对偏差不超过±10.0%。

2.9 质控品2.9.1赋值有效性：测定值在质控靶值范围内。

2.9.2 均一性：CV≤5.0%。

高效液相色谱法（HPLC）测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA摘要：建立了一种快速测定保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA含量的HPLC分析方法。

以C 18（Hypersil ODS2 5μm）色谱柱为固定相，以缓冲液A（0.2mol/L磷酸钠，pH=5）和缓冲液B（800mL 0.25mol/L磷酸钠，pH=5和200mL乙腈的混合物）为流动相，梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温25℃，采用紫外检测器（254nm）进行检测。

结果表明：该方法可以在17min 内实现Acetyl-CoA与其他物质完全分离和定量，Acetyl-CoA在0.011~0.359μmol/mL范围内的线性关系良好，回归方程线性相关系数R2=0.9995，检出限（以信噪比（S/N）为3计）为0.28mg/L，定量限（以S/N为10计）为0.32mg/L。

该方法用于保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA含量的测定，相对标准偏差（n=6）为0.75%，重现性良好，三个水平的加标回收率为94.8%~103.3%，该方法适用于保加利亚乳杆菌胞内Acetyl-CoA快速、高效分离和定量。

关键词：高效液相色谱，保加利亚乳杆菌，Acetyl-CoADetermination of intracellular Acetyl-CoA in L.bulgaricus by HPLCAbstract：A high performance liquid chromatographic （ HPLC ） method for the determination of Acetyl -CoAin Lactobacillus bulgaricus was developed . The stationary phase used were C18（ Hypersil ODS2 5μm ）chromatographic column and the two mobile-phase solvents used were buffer A（0.2mol/L sodium phosphate，pH5） and buffer B （800mL of 0.25mol/L sodium phosphate mixed with 200mL pH5 of acetonitrile ），gradientelution and at a flow rate of 1mL/min，temperature of column at 25℃，the UV detector was employed to monitorcolumn effluent at 254nm . Results indicated that ： Acetyl - CoA and other substances were completelyseparated and determined in 17min ，the linear correlation coefficients were above 0.9995 in the range of0.011 ~0.359μmol/mL. The limit of detection of acetyl coenzyme A was 0.28mg/L，the limit of quantitation ofacetyl coenzyme A was 0.32mg/L. Under these optimized conditions ，the recovery of the Acetyl -CoA inLactobacillus bulgaricus at three spiked levels were in the range of 94.8%~103.3% with the relative standarddeviations（n=6） of 0.75%. This method was fast and accurate for the quantitative analysis of the Acetyl-CoA inLactobacillus bulgaricus.Key words：high performance liquid chromatography（HPLC）；Lactobacillus bulgaricus；Acetyl-CoA中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：1002-0306（2013）22-0058-05收稿日期：2013－06－04 * 通讯联系人作者简介：李培照（1986-），男，硕士研究生，研究方向：乳酸菌代谢。

乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）含量测定试剂盒说明书货号：MS2106 规格：100管/96样乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）含量测定试剂盒说明书微量法正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。

是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。

在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。

糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。

此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

测定原理：苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。

柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A 和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。

利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。

自备实验用品及仪器：紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1支，-20℃保存。

临用前加入250μL试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；试剂三：液体10uL×1支，4℃保存。

临用前加入250μL试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存。

临用前加入22.5mL试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；试剂五：液体30mL×1瓶，4℃保存。

工作液的配制：临用前请根据拟用工作液体积（样本数×0.23 m L），将试剂二、三和四按照1:1:90的比例混合，或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀（可以测定96样）；加样前置37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴锅中预热30 min；现配现用；乙酰辅酶A的提取：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

一、实验目的1. 了解酮体的生成过程。

2. 掌握酮体代谢的基本原理。

3. 学习通过实验方法检测酮体的生成和代谢。

二、实验原理酮体（Ketone bodies）是脂肪酸在肝脏中氧化分解的产物，主要包括乙酰乙酸、β-羟基丁酸和丙酮。

当机体糖原储备耗尽，血糖供应不足时，脂肪酸氧化生成的乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）无法进入三羧酸循环（TCA cycle）进行彻底氧化，于是通过酮体生成途径产生酮体，供机体利用。

酮体生成过程分为以下几个步骤：1. 脂肪酸β-氧化：脂肪酸在细胞质中被氧化成乙酰辅酶A。

2. 乙酰辅酶A进入线粒体：乙酰辅酶A通过肉碱棕榈酰转移酶I（CPT I）进入线粒体。

3. 酮体生成：乙酰辅酶A在线粒体中缩合成乙酰乙酰辅酶A，再与另一分子乙酰辅酶A缩合成β-酮丁酸，β-酮丁酸还原成β-羟基丁酸，最终脱羧生成丙酮。

酮体代谢过程如下：1. 靶器官摄取：血液中的酮体被靶器官（如脑、肌肉等）摄取。

2. 酮体氧化：在靶器官中，酮体被重新合成成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环进行彻底氧化，产生能量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 纯净脂肪酸- 肉碱棕榈酰转移酶I（CPT I）抑制剂- 乙酰辅酶A- β-羟基丁酸脱氢酶- 丙酮- 实验试剂：磷酸缓冲液、三氯化铁溶液、硫酸铜溶液、碘液等- 实验动物：小鼠2. 实验仪器：- 离心机- 恒温水浴锅- 分光光度计- 移液器- 试管四、实验方法1. 脂肪酸氧化实验：- 将纯净脂肪酸与磷酸缓冲液混合，加入肉碱棕榈酰转移酶I抑制剂，观察乙酰辅酶A的生成情况。

- 将脂肪酸与磷酸缓冲液混合，加入乙酰辅酶A，观察酮体的生成情况。

2. 酮体代谢实验：- 将小鼠麻醉后处死，取肝脏和肌肉组织。

- 分别提取肝脏和肌肉组织中的酮体。

- 测定肝脏和肌肉组织中酮体的含量。

- 检测肝脏和肌肉组织中乙酰辅酶A的含量。

3. 酮体检测实验：- 取少量乙酰乙酸、β-羟基丁酸和丙酮，分别与三氯化铁溶液、硫酸铜溶液和碘液反应，观察颜色变化，判断酮体的种类。

乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书人胆碱乙酰化酶(CHAc)ELISA试剂盒说明书本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中CHAc含量。

实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CHAc抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CHAc抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的CHAc呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板:一块(96孔)2. 标准品(冻干品): 2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/ml，做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成10 ng/ml，5 ng/ml，2.5ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。

如配制5 ng/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液:1×20ml。

4. 检测稀释液A:1×10ml。

5. 检测稀释液B:1×10ml。

6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。

人胆碱乙酰化酶(CHAc)ELISA试剂盒说明书本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中CHAc含量。

实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CHAc抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CHAc抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的CHAc呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板：一块(96孔)2. 标准品(冻干品)： 2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/ml，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。

如配制5 ng/ml标准品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液：1×20ml。

4. 检测稀释液A：1×10ml。

5. 检测稀释液B：1×10ml。

6. 检测溶液A：1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。

如10μl 检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液B：1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。

脂肪酸β氧化速率比色法检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途脂肪酸β氧化速率（β oxidation rate）比色法检测试剂是一种旨在通过棕榈酰肉碱氧化依赖性铁氰化物还原，即单位时间还原产物的峰值降低，即采用比色法来测定线粒体裂解样品中脂肪酸β氧化速率的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种细胞、组织中线粒体裂解悬液样品（动物、人体等）脂肪酸β氧化速率的检测。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段，是体内，尤其是组织器官，例如肝脏、心脏和骨骼肌等能量内平衡的关键代谢通路。

食物中甘油三酯提供体内三分之一的能量供给，骨骼肌和心脏消耗80%的总能量。

脂肪酸代谢异常，将导致脂质聚集在非脂肪组织内，产生慢性病的病理基础，例如糖尿病、心衰、肥胖症等。

其中β氧化，包括脱氢、水合、二次脱氢和硫解，是将活化的各种长度脂酰辅酶酯（acyl CoA esters）不断缩短为乙酰辅酶A（acetyl CoA）单位，最后经过三羧酸循环和呼吸链氧化成CO2和水。

脂酰基辅酶A脱氢酶（acyl CoA dehydrogenase；AD；EC.1.3.99.3）是脂肪酸代谢进入β-氧化后工作的重要酶之一。

通过底物棕榈酰肉碱（palmitoyl carnitine）的氧化产生的电子，由铁氰化物（ferricyanide）捕获而还原，其还原速率的检测，来评价β氧化的速率，即吸光值（420nm波长）的下降与时间的对应关系。

产品内容缓冲液（Reagent A）毫升反应液（Reagent B）毫升底物液A（Reagent C）毫升底物液B（Reagent D）毫升阴性液（Reagent E）毫升产品说明书1份保存方式保存反应液（Reagent B）、底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于反应操作的容器比色皿：用于比色的容器分光光度仪：用于比色分析实验步骤一、测定准备1．准备好待测样品（例如纯化线粒体），至于冰槽里备用2．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长420nm和470nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零3．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照4．缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度二、背景对照测定1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿2．加入xx微升反应液（Reagent B）3．加入xx微升底物液A（Reagent C）4．加入xx微升底物液B（Reagent D）5．上下倾倒数次，混匀6．在25℃温度下孵育3分钟7．加入xx微升阴性液（Reagent E）8．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）9．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照【（OD420—OD470）0分钟－（OD420—OD470）5分钟】三、样品测定1．移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿2．加入xx微升反应液（Reagent B）3．加入xx微升底物液A（Reagent C）4．加入xx微升底物液B（Reagent D）5．上下倾倒数次，混匀6．在25℃温度下孵育3分钟7．加入50微升待测样品（500微克线粒体蛋白）（注意：样品须清澈）8．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）9．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数【（OD420—OD470）0分钟－（OD420—OD470）5分钟】四、计算氧化速率注意事项1．本产品为20次操作，包括背景对照2．操作时，须戴手套3．系统操作过程中，背景测定只需1次4．样品须澄清，至关重要5．加样后3秒内比色测定6．测定值由高到低变化；测定可持续5分钟7．比色测定后，比色皿须清洗彻底8．样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有氧化功能9．建议待测样本线粒体蛋白浓度为500微克/50微升（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度11．本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。

酮体含量检测试剂盒（血清、血浆、尿液等）说明书紫外分光光度法货号：UPLC-MS-6025规格：50T/48S产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件试剂一A液液体55mL×1瓶4℃保存试剂一B液液体55mL×1瓶4℃保存试剂二A液粉剂×2支-20℃保存试剂二B液粉剂×2支-20℃保存试剂三粉剂×3支-20℃保存标准品1粉剂×1支4℃保存标准品2粉剂×1支-20℃保存溶液的配制：1、试剂二A液：临用前取一支加入1.2mL蒸馏水，充分溶解。

用不完的试剂分装后-20℃可保存3周。

避免反复冻融；2、试剂二B液：临用前取一支加入600μL蒸馏水，充分溶解。

用不完的试剂分装后-20℃可保存3周。

避免反复冻融；3、试剂三：临用前取一支加入400μL蒸馏水，充分溶解。

用不完的试剂分装后-20℃保存，可以保存3周。

避免反复冻融；4、标准品1：8mg3-羟基丁酸钠。

临用前加入0.98mL蒸馏水，充分溶解，即8mg/mL3-羟基丁酸钠标准溶液，4℃可以保存4周。

临用前根据试验所需量用蒸馏水稀释成0.2mg/mL标准溶液待用，即为标准溶液1；5、标准品2：8mg乙酰乙酸锂。

临用前加入0.95mL蒸馏水，充分溶解，即8mg/mL乙酰乙酸锂标准溶液，-20℃可以保存4周。

临用前根据试验所需量用蒸馏水稀释成0.05mg/mL标准溶液待用，即标准溶液2；6、BOH工作液配制：临用前根据试验所需量将试剂一A液、试剂二A液、试剂三按照850μL:40μL:10μL（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混匀，置于37℃保温15min（此步骤不可省略），现用现配，工作液在4h内用完；7、AcAc工作液配制：临用前根据试验所需量将试剂一B液、试剂二B液、试剂三按照870μL:20μL:10μL（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混匀，置于37℃保温15min（此步骤不可省略），现用现配，工作液在4h内用完。