抗生素发酵工艺学知识要点

《抗生素发酵工艺学》知识要点（1）发酵工业的生产水平取决于三个要素，即生产菌种、生产工艺、生产设备。

（2）目前无菌检测的方法主要四种，即镜检法、肉汤培养法、平板划线培养和发酵过程异常现象观察法。

（3）发酵醪中菌体分离一般采用离心分离和过滤分离两种方法。

（4）在微生物培养过程中，引起培养基pH值改变的原因主要有营养成份的消耗和代谢物的累积等。

（5）发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。

（6）发酵工业中常用灭菌方法：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌。

（7）常用工业微生物可分为细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四大类。

（8）常用菌种保藏方法有斜面保藏法、沙土管保藏法、液体石蜡保藏法和真空冷冻保藏法等（9）发酵高产菌种选育方法包括自然选育、杂交育种、诱变育种、基因工程育种、原生质体融合（10）发酵产物整个分离提取路线可分为预处理、固液分离、初步纯化、精细纯化和成品加工等五个主要过程。

（11）工业微生物菌种可以来自自然分离，也可以来自从微生物菌种保藏机构单位获取。

（12）环境无菌的检测方法有显微镜检查法、肉汤培养法、平板培养法、发酵过程的异常观察法等。

（13）发酵罐发酵过程中的物理检测参数有温度、转速、压力、搅拌转速和空气流量）。

（14）前体：是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大提高的化合物。

（15）发酵生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

（16）生理性酸性物质：经微生物代谢等作用后能形成酸性物质使培养基pH值下降的营养物质。

（17）限制性基质：微生物生长速率与底物浓度有一定的依赖关系，当底物浓度很小，微生物生长速率与底物浓度成正比，此时基质叫限制性基质。

（18）发酵热：所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。

什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。

这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。

发酵热引起发酵液的温度上升。

发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升。

（19）染菌率：总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。

染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。

（20）连消：连消也叫连续灭菌，就是将将配制好的并经预热（60～75℃）的培养基用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使其在短时间内达到灭菌温度（126～132℃），然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持5～7分钟后再进入冷却管，使其冷却至接种温度并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）的发酵罐内的培养基灭菌方法。

其过程均包括加热、维持和冷却等灭菌操作过程。

（21）DE值（葡萄糖值）：表示淀粉水解程度及糖化程度，指葡萄糖（所有测定的还原糖都当作葡萄糖来计算）占干物质的百分率。

（22）补料分批培养：在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。

在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。

在工厂的实际生产中采用这种方法很多。

（23）次级代谢产物：从初级代谢途径中形成分枝代谢途径，并用初级代谢产物生成与菌体生长繁殖无关的物质或功能还未明的化合物，这个过程称次级代谢。

（24）种子培养基有何特点？a)有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；b)各种营养物质的浓度不必太高；c)供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；d)应考虑与发酵培养基的主要成分相近。

（25）泡沫对发酵有何影响？常用的消泡方法有何优缺点？泡沫对发酵的影响有：（1）泡沫持久存在，妨碍CO2的排除，影响微生物对氧的吸收，破坏正常生理代谢，不利发酵和生物合成。

（2）泡沫大量产生，使发酵罐有效容积大大减少，影响设备利用率。

（3）泡沫过多，控制不好，会引起大量跑料，造成浪费和环境污染（4）泡沫升到灌顶，可能从轴封渗出，增加染菌机会（5）泡沫过多也会影响氧传递、通风与搅拌效果。

（6）化学消泡优点：化学消泡剂来源广泛，消泡效果好作用迅速可靠，用量少，不需改造设备，大小规模适用，易实现自动控制。

缺点：消泡剂对微生物生长有毒性。

（7）物理消泡优点：不用在发酵液中加其他物质，节省原料，减少由于加消泡剂引起的污染机会。

缺点：不如化学消泡迅速、可靠，需一定设备及消耗动力，不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。

（26）什么是半连续培养，说明其优缺点。

•在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。

某些品种采取这种方式，如四环素发酵，优点：放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。

缺点：代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大；（27）发酵级数确定的依据是什么？•答：（1）一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数，谷氨酸：三级发酵，一级种子（摇瓶）→二级种子（小罐）→发酵；青霉素：三级发酵，一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵。

•（2）发酵级数确定的依据：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。

•（3）级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

•（4）在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面（28）如何选择最适发酵温度？•1、根据菌种及生长阶段选择。

微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。

在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。

发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。

•2、根据培养条件选择。

温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。

通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。

培养基稀薄时，温度也该低些。

因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。

•3、根据菌生长情况，菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。

培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。

总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。

要通过反复实践来定出最适温度。

（29）简述发酵工业经历的几个不同阶段答：发酵工业经历了以下几个不同阶段：(1)自然发酵时期；(2)纯培养技术的建立；(3)通气搅拌（好气性）发酵（工程）技术的建立；(4)人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术的建立；(5)开拓新型发酵原料时期；(6)与基因操作技术相结合的现代发酵工程技术阶段。

（30）发酵过程中pH会不会发生变化？为什么？发酵过程中pH是不断变化的，1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。

糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一；2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。

3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降；4）某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。

如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

5）菌体自溶pH上升，发酵后期，pH上升；6）杂菌的污染，pH下降等。

31、简述氧为何容易成为好氧发酵的限制性因素？如何调节摇瓶及发酵罐发酵的供氧水平？（1）氧是需氧微生物生长所必需的。

氧往往容易成为控制因素，是因为氧在水中的溶解度很低，培养基因含有大量的有机和无机物质，氧的溶解度比水中还要更低。

在对数生长期即使发酵液中的氧浓度达到饱和，若此时终止供氧，发酵液中的溶氧可在几分钟内全部耗尽，使溶氧成为控制因素。

细胞浓度直接影响培养液的摄氧率，在分批发酵中摄氧率变化很大，不同生长阶段需氧不同，对数生长后期达最大值。

培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率，碳源种类对细胞的需氧量有很大影响，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。

（2）摇瓶往复培养，频率80-120分/次，振幅8cm；旋转培养，偏心距转速250rpm；摇瓶装液量，一般取1/10左右（250ml ，15-25 ml；500ml ，30 ml；750ml ，80 ml）。

（3）发酵罐通气，一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。

但是通气增大的时间一定要把握好。

32、简述代谢网络假说的要点代谢网络假说的要点包括：1) 代谢途径（中心、注入、发散）交织形成网络；2) 分解代谢和合成代谢具有单向性；3) ATP是通用的能量载体；4) NAD(P)H 以还原当量形式携带能量。

33、发酵过程中染菌的判断与检查以无菌试验中的酚红肉汤培养和双碟培养的反应为主,，以镜检为辅。

每个无菌样品的无菌试验，至少用2只酚红肉汤或斜面同时取样培养。

要定量或用接种环蘸取法取样，不宜从发酵罐直接取样。

因取样量不同,影响颜色反应和浑浊程度的观察。

如果连续3个时间的酚红肉汤无菌样发生颜色变化或产生浑浊,或斜面连续3个时间样品长出杂菌即判断为染菌。

有时酚红肉汤反应不明显,要结合镜检确认连续3个时间样品染菌，即判为染菌。

34、种子罐和发酵罐发现染菌后的处理•种子罐染菌后都不能往下道工序移种,要及时用高压蒸汽直接灭菌后经过滤处理。

发酵罐染菌的处理：发酵罐前期染菌,污染的杂菌对产生菌的危害性大, 采用蒸汽灭菌经过滤处理后放掉;如果危害性不大, 可用重新灭菌、重新接种的方式处理,如营养成分消耗较多,可放掉部分培养液补入部分新培养基后进行灭菌,重新接种；如污染的杂菌量少且生长缓慢,可以继续运转下去,但要时刻注意杂菌数量和代谢的变化。

•在发酵的中后期染菌,一是加入适量的杀菌剂, 如呋喃西林或某些抗生素,抑制杂菌的生长。

二是降低培养温度或控制补料量来控制杂菌的生长速度。

如果采用上述两种措施仍不见效,就要考虑提前放罐；•染菌后的设备处理：染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理,再用蒸汽灭菌〈包括各种附属设备〉。

在再次投料之前,要彻底清洗罐体、附件,同时进行严密程度检查,以防渗漏。

染菌后的处理尤为重要，很多大面积染菌都是由于处理不彻底而造成的系统污染，造成无法及时处理好各个环节出现连续污染。

35、如何防止染菌？•提高空气进口的空气洁净度；除尽压缩空气中夹带的油和水,保持过滤介质的除菌效率。

在夏秋两季，由于空气湿度较大可能出现预过滤器放出水的现象，因此定时放水。