DPPH自由基SOP

氮⾃由基（DPPH）清除⼀．实验原理：DPPH（11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即11-⼆苯基-2-苦基肼基⾃由基，DPPH⾃由基是⼀种较稳定的含氮⾃由基，有⼀个单电⼦，在517nm下有强吸收，如果有其他物质提供⼀个电⼦使此单电⼦配对，其吸收会消失褪⾊，褪⾊程度与接受电⼦的量呈正⽐。

即反应物清除氮⾃由基的能⼒与试剂在517nm的吸光值成反⽐。

⼆．实验仪器：分光光度计三．实验试剂：试剂⼀：DPPH试剂1mL×1瓶试剂⼆：100µg/mL 维⽣素C标准溶液 20mL×1瓶四．溶液配制：试剂⼀：37℃平衡20min以上，待试剂融化后，在试剂瓶中加⼊100ml 95%⼄醇或⽆⽔⼄醇，剧烈震荡使试剂充分溶解。

注意：溶解⼀定要充分，如有条件可采⽤超声波助溶。

试剂⼆应⽤液：根据是否需要制作阳性对照标准曲线有两种配制⽅法。

1. 如仅需要将维⽣素C作为质控品，可取100µL 试剂⼆，加⼊900µL样品稀释液，充分混匀；2. 如需测定维⽣素C的IC50，可分别移取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0mL 试剂⼆于空离⼼管中，再依次加⼊10.0，9.5，9.0，8.5，8，7.5，7.0，6.0，5.0ml样品稀释液，充分混匀。

配制成0，5，10，15，20，25，30，40，50 µg/mL 维⽣素C样品。

五．实验步骤:六．清除能⼒计算：氮(DPPH)⾃由基清除清除能⼒(%)=[空⽩孔吸光值-(测定孔吸光值-对照孔吸光值)]/空⽩孔吸光值*100%七．注意事项：1. 如样品中⾊素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进⾏脱⾊处理，处理后样品可不做对照孔；2. 如不确定样品的氮⾃由基清除能⼒，可先做不同浓度的稀释液进⾏摸索，并选择适宜浓度进⾏测定，⾼浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。

DPPH法测定黄苓黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。

目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。

DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。

它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。

向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH •使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。

即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH •的效果，来计算抗氧化能力。

实验研究表明，黄苓黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄苓苷[1]，黄苓苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下：O2NN02 NO2DPPH与抗氧化剂反应原理材料：DPPH（ 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇;仪器：分光光度计1. DPPH贮备液的制备准确称取DPPH试剂3 . 5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol / L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。

2. 试液的制备（只作参考）准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物（32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol/L 试液。

3. DPPH-清除率的测定在10mL比色管中依次加入 4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值（A），吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。

DPPH·自由基清除法(修改版)李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.6）【原理】1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, 简称为DPPH·自由基。

由于分子中存在大π键，所以，该自由基能稳定存在。

且在519nm处，有最大吸收波长。

当DPPH·自由基被清除时，其在519nm处的吸光度（A519nm），会相应地减少。

因此，通过检测A519nm值，可以判断DPPH·是否被清除。

如果某个样品能清除DPPH·，就具有一定的自由基清除活性（或称“抗氧化活性”）。

【操作图解】【计算公式】【说明】1. 样品溶液的浓度，也是可以调整的。

不过，为了方便实验，宜配高浓度（如3mg/mL）。

2. 操作图解中的用量，都是可以调整的，需要自行摸索。

3. 当样品溶液的加入量为0 μL 时，所测得的A值即为A0。

4. 实验最好做三个平行样，以减少误差。

【实例】二氢杨梅素的DPPH清除实验的结果二氢杨梅素样品：浓度：0.1mg/ml 溶剂：95%乙醇数据整理：二氢杨梅素原始数据：水溶液中“普用”自由基清除的实验操作图2019.6 【参考文献】Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PT IO•) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural & Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.【简介】“普用”自由基，原名是PTIO自由基。

它是一种能溶于水的自由基，所以，可以在水溶液中进行自由基的清除实验。

这比DPPH自由基清除实验更合理；因为DPPH自由基清除只能是有机溶剂（如乙醇、甲醇）中进行。

2024DPPH清除自由基方法2024年，一种新的清除自由基的方法被引入，该方法使用DPPH试剂。

DPPH（1,1-二苯基-2-三甲基-苦基-2-脒基），是一种广泛应用于生物医学研究中的人工氧化剂。

DPPH试剂呈紫色，并且可与捕获自由基反应后转变成无色。

因此，通过测量DPPH试剂的颜色变化，可以评估抗氧化物质对自由基的清除能力。

DPPH清除自由基方法是一种简单、快速且经济的方法。

它适用于各种类型的样品，包括天然产物、食品、药物和化妆品。

使用DPPH试剂测定抗氧化能力的方法主要有两种：溶液试剂法和固相试剂法。

溶液试剂法是最常用的DPPH清除自由基方法之一、在这种方法中，首先将DPPH试剂以适当浓度溶解在溶剂中，通常使用甲醇或乙醇。

然后，将样品与DPPH溶液混合，反应一定时间。

在反应过程中，DPPH试剂将与样品中的抗氧化物质反应，使DPPH试剂转变为无色。

通过测量反应溶液的吸收光谱或测定其吸光度的变化，可以计算出样品的清除自由基能力。

固相试剂法是一种近年来发展起来的新方法。

在这种方法中，固定DPPH试剂在固相载体上，通常使用硅胶或其他吸附剂。

样品溶液被滴加到载体上，自由基会与固相DPPH试剂发生反应，并转变成无色。

然后，通过测量吸附剂的颜色变化或对比吸附剂的吸光度，可以确定样品的清除自由基能力。

DPPH清除自由基方法的优点之一是它不需要复杂的仪器设备，因此可以应用于各种实验室条件。

此外，DPPH试剂的制备相对简单，价格也相对较低。

这使得DPPH清除自由基方法成为研究抗氧化剂的吸引人选择。

然而，DPPH清除自由基方法也存在一些限制。

首先，DPPH试剂只能评估清除自由基的能力，而不能提供有关抗氧化物质的详细信息。

此外，该方法不能区分不同类型的自由基，因此不能用于研究具体自由基类型的清除能力。

最后，溶液试剂法和固相试剂法都需要一定时间的反应才能得到准确的结果，这可能会造成实验中的误差。

总的来说，DPPH清除自由基方法是一种简单有效的方法，用于评估样品的抗氧化能力。

DPPH自由基清除能力试剂盒说明书（货号：G0128F分光法48样）一、产品简介：DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。

广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。

此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。

当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，呈现的颜色越浅，即A值越低，进而对样本中DPPH清除能力进行定量分析。

二、试剂盒的组成和配制：试剂名称规格保存要求备注工作液粉剂×1瓶4℃保存临用前甩几下使试剂落入底部，再加入38mL无水乙醇充分溶解备用；用不完的试剂4℃避光保存;标准品粉剂×1支4℃保存若重新做标曲，则用到该试剂三、所需的仪器和用品：可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、离心机、可调式移液器、研钵、冰、甲醇、无水乙醇和蒸馏水。

四、DPPH自由基清除能力测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备：①组织样本：称取约0.1g新鲜组织或者称取约0.05g烘干样本（将样本在105℃下杀青3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，得到烘干样本），加入1mL的80%甲醇提取液（若鲜样需研磨均质），于60℃，200-300W条件下超声提取30min（间隔5min振荡混匀一次），若有损失需用80%甲醇定容至1mL。

12000rpm室温离心10min，取上清测定。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取②细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 80%甲醇提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm室温离心10min，取上清测定。

主要目的：——为了测定样品清除DPPH自由基的能力。

主要原理：——自由基清除剂与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用酶标仪进行快速的定量分析。

实验室签章一、试剂——1 ,1-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH）——甲醇（分析纯）二、仪器设备——96孔酶标板——UV-Vis可见多功能酶标仪——移液枪——200 µL量程枪头三、实验方法◆前期准备配置2 g/L 的DPPH甲醇标准溶液。

◆DPPH自由基清除能力参照Brand-Williams (1995)[1]报道的方法，将其稍加改动后应用在96孔酶标板中[2]。

在酶标板的每孔中，依次加入不同体积（10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 µL）的样品溶液和200 μL的DPPH标准溶液（2 g/L），最后用甲醇溶液补齐至总体积300 µL。

室温反应30 min后，于515 nm下用UV-Vis可见多功能酶标仪测定其吸光度（EL 340, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA）。

番茄样品消除自由基的能力表示为EC50（清除1 µg DDPH至50 %所需的样品用量（µg干重））。

EC50越小，表示抗氧化活性越高。

平行测定三次，取平均值计算。

清除DPPH自由基能力用如下公式计算：清除率%=（1-Ac AjAi）×100%其中：Ai为样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度，Aj为样品溶液加甲醇的吸光度，Ac为DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。

[1] Brand-Williams W, Cuvelier M E. Berset C. Use of a free radical method to evaluateantioxidant activity [J]. LWT - Food Science and Technology, 1995, 28(1): 25-30.[2] Verma A R, Vijayakumar M, Rao C V. Mathela C S. In vitro and in vivo antioxidant propertiesand DNA damage protective activity of green fruit of Ficus glomerata [J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(2): 704-709.。

DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH•) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evidence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxide (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simple Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。

概述如下表：ABTS•自由基ABTS·+再稀释得其工作液。

紫色墨绿色蓝紫色1(50 μg/mL) (50 μg/mL)（0.07mM (NH)ABTS+0.03mM K S O）2（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。

（3）虽然DPPH的清除主要是HAT抽制，但是在不同溶剂中，其抗氧化机制是不同的，还可能有ET等。

DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。

目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。

DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。

它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。

向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。

即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH·的效果，来计算抗氧化能力。

实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷[1]，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下：N N+O2NO2NNO2H+N NHO2NO2NNO2 DPPH与抗氧化剂反应原理材料：DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇；仪器：分光光度计1.DPPH贮备液的制备准确称取DPPH试剂3．5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol／L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。

2.试液的制备(只作参考)准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物（32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol／L 试液。

3.DPPH·清除率的测定在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。

DPPH 自由基清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC4750 规格：50T/24S产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称 规格 保存条件 提取液 液体50 mL×1瓶 2-8℃保存 试剂一 液体60 mL×1瓶（自备）常温保存 试剂二 粉剂×1瓶 2-8℃保存 试剂三粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制：1、 试剂一：无水乙醇自备；2、 试剂二：粉剂置于瓶内EP 管中。

临用前加入6.08 mL 试剂一振荡溶解，用不完的试剂可于-20℃保存1个月，建议分装保存，避免反复冻融；临用前根据试验所需量按照试剂二：试剂一（V:V ）= 4：21的比例配制成工作液，现配现用，用不完的工作液可于2-8℃保存一周；3、 试剂三：10 mg 维生素C 。

临用前加入1 mL 提取液，充分振荡溶解，配成10 mg/mL 维生素C 溶液，2-8℃保存两周；用于阳性对照。

产品说明：DPPH 自由基一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。

DPPH 自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在515 nm 处有强吸收。

当有抗氧化剂存在时，DPPH 自由基被清除，其溶液颜色变浅，515 nm 的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。

本试剂盒中，通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH 自由基的能力。

DPPH · DPPH ·H注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50目筛和蒸馏水。

操作步骤：一、样本的制备（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）（1）植物样本的制备：将新鲜样本置于60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过30~50目筛。

dpph自由基清除原理
DPPH自由基清除原理是指通过DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）这种常用的自由基抗氧化剂来评价植物提取物或化合物的抗氧化性能。

DPPH是一种紫色自由基分子，其在溶液中呈金黄色。

当遇到捕获电子的抗氧化物质时，DPPH自由基中的氮原子上
的单独电子会被转移给抗氧化剂，使DPPH自由基变为无色。

这个转变过程可以通过测量溶液的吸光度变化来定量评估抗氧化能力。

在实验中，通常用DPPH溶液滴加待测物质溶液，
并观察溶液的颜色变化。

颜色越浅，表示抗氧化能力越强。

通过测量DPPH清除率，可以定量评估化合物或提取物的抗氧
化活性。

该方法简单、迅速且成本较低，因此被广泛应用于抗氧化剂的筛选与评价。