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植物细胞色素P450基因的异源表达系统研究进展

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型的氧化反应, 在植 物生命活动中有重要功能 , 其研究一 直受到重视 。 自 1990 年第一个植物 P450 基因成功克隆以来, 到 2002 年年底 , 已有 600 多个 P450 基因被克隆 , 有 100 多个基因在细 菌、 酵母、 杆状病毒昆虫细胞等异源表达系统中成功表达并鉴定了功能 。拟对植物 P450 的大肠 杆菌 、 酵母 、 杆状病毒昆虫细胞表达系统的特点进行比较, 对在各表达系统中成功表达并进行了 功能鉴定的植物 P450 进行归纳, 并对目前植物 P450 异源表达的现状和应用进行概述 。 关键词 细胞色素 P450 氧化酶 酵母表达系统 大肠杆菌表达系统 杆状病毒介导的昆虫细 胞表达系统 细胞色素 P450 氧化酶( 简称 P450) 是一类具有 多种催化功能含血红素的氧化酶系, 植物 P450 在 植物体内具有重要的功能 , 可以催化许多初级和次 级代谢反应。反应底物包括脂类、 苯丙烷类、 黄酮 类、 萜类、 生物碱类、 生氰糖苷等内源性化合物以及 包括农药、 除草剂等在内的外源物质。由于植物组 织中存在许多干扰 P450 研究的因素 , 如叶绿体和 其他血红素蛋白光吸收的干扰 , P450 类型较多而 相对含量较少, 其纯化十分困难, 使植物 P450 的分 离及重组这些膜结合酶系的工作进展有限。早期 植物 P450 反应大多是根据光可逆转 CO 抑制以及 诱导剂与抑制 剂辅助实验来 鉴定, 只有 少数植物 P450 的活性在分子水平上得到了证明。随着分子 生物学的发展 , 克隆 P450 基因并测定它们的生物 化学功能已成为植物 P450 研究的核心。目前, 植 物 P450 基因克隆及表达研究进展很快, 数据库不 断更新 , 截至 2002 年底 , 已定名的植物 P450 约有 600 多个 , 分属于 54 个家族 ( http: drnelson. utmem. edu cytochrome P450. html) 。 当某一全长未知功能的 P450 cDNA 被克隆后, 一个适合该 P450 cDNA 表达系统的建立就成为鉴 定 P450 的重要条件。目前, 具有酶催化活性的植 物 P450 蛋白已经成功地在细菌、 酵母和杆状病毒 介导的昆虫细胞表达系统中得到表达。现以苎烯 3 羟化酶( CYP71D12) 和苎烯 6 羟化酶 ( CYP71D18) 为例 , 谈谈这 3 种表达系统的使用。 薄荷属环化单萜类有较大商业价值 , 其链烯前 体 4S 苎烯的立体选择性羟化反应是由苎烯羟化酶 催化形成的。苎烯 6 羟化酶最先从留兰香油腺微 粒体中纯化得到, 根据该酶的部分氨基酸序列设计 合成引物克隆得到 500bp 左右的核苷杆状病毒为载体将其导入昆虫 Sf 9 细 胞进行功能表达研究, 表达产物被证实是 C6 羟化 酶。表达系统进行功 能研究后证实其表达产物为 C3 羟化酶。氨基酸序 列分析推断 C6 羟化酶与 C3 羟化酶都是细胞色素 P450 单加氧酶 , 均有一个典型的氨基 末端膜结合 域, 与微粒体蛋白的天然定位一致。重组羟化酶及 其编码基因的研究结果有助于正确理解细胞色素 P450 蛋白与底物的 结合催化, 构成了 一个分析细 胞色素 P450 蛋白结构 功能关系的模式系统 。 杆状病毒介导的昆虫细胞虽然适于 P450 苎烯 羟化酶 cDNA 的表达和功能鉴定, 但该系统比较繁 琐, 且 蛋 白 质 表 达 水 平 较 低。 此 后 不 久, Haudenschild 等建 立了 相应 的大 肠杆菌 和酵 母系
[ 1]
收稿日期 : 2003 03 25 目 ( 2001AA234021)
修回日期 : 2003 05 14
* 国家自然科学基金资助项目 ( 20172071) , 国 家 863 计划资助项 * * 通讯作者 , 电子信箱 : chengkd@ imm. ac. cn
第7 期
涂
等 : 植物细胞色素 P450 基因的异源表达系统研究进展
[ 4]
1
酵母表达系统
目前 , 在异源表达系统中表达并得到功能鉴定
的 P450 蛋白约有 100 个 , 包括多个植物 P450 家族, 有 50 个以上的植物 P450 成功地在酵母系统中表 达并进行了功能鉴定 , 其中第一个成功在酵母系统 表达的植物细胞色素 P450 是 CYP71A1 。表 1 汇 集了目前已发表的在酵母中成功表达的例子。 植物 P450 在酵母系统中的表达水平存在很大 的差异 , 表达水平差异的主要原因可能与 P450 酶 的稳定性不同及载体 有关。如 cDNA 的非翻译区 可能抑制转录和翻译。在许多可供选择的不同系 列载体中如 PYeDP, PGY, PYES 等 , PYeDP 系列是 最常用的植物 P450 酵母表达载体 , 可产生高表达 的 P450 蛋白。这一系列载体有的采用磷酸甘油激 酶的组成型启动子, 有的采用 GAL10 CYC1 半乳糖 可诱导启动子, 它可通过改变介质中葡萄糖和半乳 糖的量来调控 P450 蛋白的表达水平。在植物 P450 表达中广泛使用的是酵母株 W( N) 及其系列 , 也有 使用 AH22 株进行 表达。这些株系的 差别主要在 [ 4] 于标记和突变有所不同 。 因酵母内源性 CPR 可以支持电子向植物 P450 传送, 酵母表达系统本身可望实现植物 P450 的催
中 第 23 卷第 7 期
国 生
物
工
程
杂
志 2003 年 7 月
CHINA BIOTECHNOLOGY
植物细胞色素 P450 基因的异源表达系统研究进展
涂 朱 平 程克棣
** 北京 100050) ( 中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所 卫生部天然药物生物合成重点实验室
*
摘要
细胞色素 P450 氧化酶是一类具有多种催化功能含血红素的氧化酶系 。由于参与多种类[ 3]源自34中国 生
物
工
程
杂
志
第 23 卷
表 1 在酵母表达系统成功实 现功能鉴定的植物 P450
P450 亚家族 CYP51 CYP71A1 CYP71A10 CYP71A11 CYP71B7 CYP71C1 CYP71C2 CYP71C3 CYP71C4 CYP71D12 CYP71D18 CYP71D20 CYP73A1 CYP73A3 CYP73A5 CYP73A10 CYP73A11 CYP73A15 CYP73A30 CYP73A31 CYP75A1 CYP76B1 CYP76B6 CYP78A1 CYP79B2 CYP81B1 CYP81B2 CYP84A1 CYP85A1 CYP86A1 CYP88A1 CYP93A1 CYP93B1 CYP93B2 CYP93B6 CYP93C2 CYP94A1 CYP94A5 CYP98A3 CYP98A6 CYP701A3 CYP725A1 催化活性 酶的名称 obtusifoliol 14 脱甲基酶 对 氯 N 甲基苯胺 脱甲基酶 苯基脲类羟化酶 N 脱甲基酶 苯基脲类羟化酶 N 脱甲基酶 7 乙氧香豆素或 7 乙氧基试卤灵脱乙基酶 HBOA 合酶 吲哚灵 2 one 羟化酶 HBOA N 羟化酶 吲哚灵 2 one 合酶 ( ) 4S 苎烯 3 羟化酶 ( - ) 4S 苎烯 6 羟化酶 5 表 马兜玲烯 1, 3 双氧酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 反式肉桂酸 4 羟化酶 类黄酮 3 , 5 羟化酶 7 乙氧香豆素脱乙基酶 牛儿醇 10 羟化酶 月桂酸 12 羟化酶 转换色氨酸为吲哚 3 乙醛肟 脂肪酸链内羟化酶 参与绿麦隆的代谢 阿魏酸 5 羟化酶 油菜类固醇 6 氧化酶 脂肪酸 羟化酶 ( C16 ) 植物种名 Triticum aestivum Persea ameri cana Glyci ne max Ni coti ana tabacum Arabidopsis thali ana Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays M entha piperita M entha spicat a Ni coti ana tabacum H elianthus tuberosus Medicago sativa Arabidopsis thali ana Petroseli num crispum Glyci ne max Phasedus vulgaris Li thosperum erythrorhizon Li thosperum erythrorhizon Petunia hybrida H elianthus tuberosus Cantharanthus roseus Zea mays Arabidopsis thali ana H elianthus tuberosus Ni coti ana tabacum Arabidopsis thali ana Lycopersicon esculentum Arabidopsis thali ana Arabidopsis thali ana Glyci ne max Glycyrrihiza echinata Gerbera hybrids Glyci ne max Glycyrrihiza echinata Vicia sativa Ni coti ana tabacum Arabidopsis thali ana Li thosperum erythrorhizon Arabidopsis thali ana Taxus cus pidata 羟化酶 ( C18 ) 羟化酶 ( C18 ) 参考文献 Biochem Biophys Res Commun, 1997, 130( 2) : 381~ 385 Plant Physiol , 1992, 100: 1976~ 1980 PNAS , 1999, 96: 1750~ 1755 Plant Biotech, 1998, 15( 4) : 173~ 176 Arch Biochem Biophys, 1997, 34( 1) : 104~ 111 M ol G en Genet, 1995, 246: 100~ 109 M ol G en Genet, 1995, 246: 100~ 109 M ol G en Genet, 1995, 246: 100~ 109 M ol G en Genet, 1995, 246: 100~ 109 Arch Biochem Biophys, 2000, 379( 1) : 127~ 136 Arch Biochem Biophys, 2000, 379( 1) : 127~ 136 Arch Biochem Biophys, 2001, 393( 2) : 222~ 235 Eur J Biochem, 1994, 222: 843~ 850 Arch Biochem Biophys, 1993, 305( 2) : 509~ 515 Plant Physiol , 1997, 113( 3) : 755~ 763 Plant Physiol , 1999, 119( 1) : 49~ 56 M ol G en Genet, 1998, 258, 315~ 322 Plant Mol Biol, 1999, 39( 6) : 1079~ 1090 Plant Cell Report , 2001, 20: 655~ 662 Plant Cell Report , 2001, 20: 655~ 662 Nature, 1993, 366: 276~ 279 Plant J, 1998, 14( 1) : 111~ 120 Biochemist ry, 38: 6093~ 6103 Biosci Biotech Biochem, 2000, 64( 8) : 1696~ 1701 J Biol Chem, 2002, 275: 33712~ 33717 J Biol Chem, 1998, 273( 13) : 7260~ 7267 Plant Biotechnology, 1998, 15( 4) : 173~ 176 PNAS , 1999, 96( 18) : 10045~ 10050 PNAS , 1999, 96( 4) : 1761~ 1766 Biochem Biophys Res Commun, 1998, 243( 3 ) : 688 ~ 693 Biochem Biophys Res Commun, 1998, 243( 3 ) : 688 ~ 693 FEBS Lett , 1998, 432( 3) : 182~ 186 Plant J, 1999, 20( 5) : 611~ 618 Plant J, 1999, 20( 5) : 611~ 618 Plant Cell Physiol, 2000, 42( 12) : 1338~ 1344 Nat Biot ech, 2000, 18: 208~ 212 Biochem J, 1998, 332, 583~ 589 Eur J Biochem, 2001, 268( 10) : 3083~ 3090 Plant Physiol , 2002, 130( 1) : 210~ 220 FEBS Lett , 2002, 514( 2- 3) : 219~ 224 Plant Physiol , 1999, 119: 507~ 510 PNAS , 2001, 98( 4) : 1501~ 1508

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细胞色素P450的特性

细胞色素P450的特性

细胞色素P450的特性及其研究进展摘要：细胞色素P450是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶，在生物体内分布广泛，主要催化机体内源和外源性物质在体内的氧化反应。

在临床药物的生物学转化中，它参与大部分药物的生物氧化，因此具有重要的生物学意义。

关键词：细胞色素P450 特性机理功能Characteristics of cytochrome P450 and its research developmentABSTRACT: Being the terminal oxidase component of mixed function oxidase system in the membrane of endoplasmic reticulum, cytochrome P450 (CYP450) has been found in all living organisms and can catalyze the oxidation of a variety of endogenous and xenobiotic compounds. This article reviewed the mechanistic explorations onCYP450- catalyzed reactions , especially the recent investigations on the mechanism of ethanol oxidation catalyzed by CYP450, as well as those in CYP450 drug metabolism.Keywords cytochrome P450;structure; catalytic mechanism; function前言细胞色素P450是一组结构和功能相关的超家族基因编码的含铁血红素同工酶，主要存在于肝细胞平滑肌内质网内，由血红素蛋白、黄素蛋白及磷脂三部分组成，相对分子质量在40 000—60 000之间，因其具有血色素类似的结构，且其还原态与一氧化碳作用后，在450nm处有一个吸收高峰，因此而被命名为细胞色素氧化酶P450[1]。

细胞色素P450 mRNA表达研究进展

细胞色素P450 mRNA表达研究进展

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医 研究 志 ２ ７ 月 学 杂 ０ 年７ 第３卷 第７ ０ ６ 期
・ 学置沼 ・ 医
细 胞 色 素 Ｐ ５ ＮＡ 表 达 研 究 进 展 ４０ｍＲ
陈立兵 葛卫红 林 洁 赵 晓英 姚敏 丽 杨 悦 细胞 色 素 １ ５ （ｙｏｈｏ ４ ０， Ｙ ） 广泛 存 ） ０ ｃｔ ｒｍｅＰ ５ Ｃ Ｐ 是 ４ ｃ 在于 生物 体 内的一 类 含血 红素 和硫 羟基 的 蛋 白 ， 要 主 存在 于 内分泌 组织 、 滑肌 组织 、 、 、 、 平 肝 肾 肺 脑及 脂 肪 组 织 的滑 面 内质 网上 。是 生物 体 的主要 Ｉ相代 谢酶 ， 参 与 多种 内、 外源 物 的代 谢 转 化 ， 仅 与 药 物 的 作 用 不 密切 相关 ， 和某 些疾 病 的发生 发 展过 程有 关 。随 着 也 现代 分子 生 物学 与基 因工 程技 术 的发展 与应 用 ， 物 药 作 用机 制 和病理 机 制 的研 究 已经 深 入 到分 子 水 平 和 基 因水 平 ， 细 胞 色 素 Ｐ ５ Ｒ Ａ的 表 达水 平 的研 对 ４ ０ｍ Ｎ 究 是其 重要 组 成部分 。
原 因是对 Ｐ ５ ｓ的诱 导 或 抑 制 。辛 华 雯 等 经研 究 ４０
认 为盐 酸小 檗碱 单 用 对 Ｃ Ｐ Ａ Ｙ ３ １的 ｍ Ｎ Ｒ Ａ表 达 无 明 显抑 制 作用 ， 与环孢 素 Ａ合用 对 Ｃ Ｐ Ａ Ｎ 但 Ｙ ３ １ｍＲ Ａ和
Ｃ Ｐ Ｅ Ｎ 表 达 均 有 明 显 抑 制 作 用 。 王 宇 光 Ｙ ２ １ｍＲ Ａ 等经 动 物 实 验 与分 析 检 测 发 现 在 ｍ Ｎ Ｒ Ａ水 平 上 ， 藜 芦 可诱 导 Ｃ Ｐ Ｃ ｌ基 因 表 达 ， 与 人 参 合 用 后 却 使 Ｙ２ ｌ 但 得 Ｃ Ｐ Ｃ １的 表 达 下 降 ； 芦 与 人 参 配 伍 诱 导 了 Ｙ２１ 藜
中药对细胞色素P450影响的研究进展

中药对细胞色素P450影响的研究进展

中药对细胞色素P450影响的研究进展中药是我国特有的一种治疗手段，已经被广泛应用于临床治疗。

其中，很多中药的功效是通过影响细胞色素P450（CYP）代谢途径来实现的。

CYP是一个大家族的细胞蛋白，它们广泛参与生理代谢和解毒，也是大多数药物的代谢酶。

因此，了解中药对CYP的影响，对于临床应用中药的安全和有效性具有非常重要的意义。

1.中药对CYP影响的分类根据不同中药成分和作用机制，可以将中药对CYP影响分为抑制、诱导、竞争和不影响4种。

抑制是指中药成分能够抑制CYP催化某些底物的代谢。

诱导是指中药成分能够增加CYP的表达和活性。

竞争是指中药成分能够与某些底物竞争结合到CYP上，抑制底物的代谢。

不影响是指中药成分对CYP没有影响。

2.CYP的代谢途径CYP按其作用对象和催化基团的不同，可以分为CYP1、CYP2和CYP3等家族。

其中CYP3家族是最广泛参与药物代谢的家族。

CYP代谢药物的过程可以分为两个步骤：首先，药物分子与CYP结合并被氧化，形成药物的代谢产物；然后，这些代谢产物被肝脏和肾脏等器官清除出体外。

3.中药对CYP影响的机制抑制CYP的机制可以分为竞争性、非竞争性和混合性。

竞争性抑制是指中药成分与底物在CYP上竞争结合，导致底物的代谢降低。

非竞争性抑制是指中药成分能够直接与CYP结合，导致CYP活性降低。

混合性抑制是指中药成分能够与CYP和底物同时结合，导致底物的代谢和CYP活性都降低。

诱导CYP的机制可以分为转录和转译两个层面。

转录指的是中药成分能够增加CYP基因的表达量。

转译指的是中药成分能够增加CYP的翻译量和稳定性。

4.中药对CYP的临床意义临床应用中药时，需要考虑它对CYP的影响。

如果中药成分能够抑制CYP，会导致药物的代谢减缓，从而容易导致药物毒性和不良反应的发生；如果中药成分能够诱导CYP，会导致药物的代谢加速，降低药效。

因此，选择中药时需要考虑其对CYP的影响，以充分发挥其治疗作用，并保证安全性和有效性。

细胞色素P450研究进展.

细胞色素P450研究进展.

1.1细胞色素P450研究进展1.1.1细胞色素P450细胞色素P450(cytochrome P450或CYP,简称P450）是一个古老的以血红素为辅基的B族细胞色素蛋白酶基因超家族，广泛存在于细菌、真菌、植物以及动物等各种生物体内[1]，通常与质体、线粒体、内质网、高尔基体等细胞器膜结合。

还原态P450与CO结合后在450nm处能检测到最大吸收峰，故命名为P450。

因其能使疏水性分子插入一个氧原子而变得更具有亲水性或者活性，因此又称之为单加氧酶(mixed-function oxidase,简称MFO)[2]。

P450酶系作为自然界中生物催化剂，它所催化的反应类型多样，最典型的反应是把分子氧还原为水的同时，将其中一个氧原子转移至底物形成产物，催化反应为[3]:RH+O2+NADPH+H+ROH+H2O+NADP+1958年，在大鼠肝微粒体中第一次发现P450。

D.S Frear于1969年首次在棉花(Gossypium hirsutum L.)中发现了它的存在[4]。

此后，大量的研究表明在拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)[5]、小麦(Triticum aestivum L.)[6]、苜蓿(Medicago sativa L.)[7]、蓖麻(Ricinus communis L.)[8]等许多植物中也均有P450存在。

P450酶系在植物中参与多种代谢反应，发挥重要的催化作用。

[1]Omura T(1999).Forty years of cytochrome P450.Biochem BiophysRes Commun,266(3):690~698.[2]Nelson D R,Kaymans L,Kamataki T,et al.P450superfamily:updateon new sequence,gene mapping,accession numbers andnomenclature[J].Pharmacogenetics,1996,6:1-42.[3]Ortiz de Montellano PR.Cytochrome P450:structure,mechanism,and biochemistry[M],3rd ed.Kluwer Academic/Plenum Press,New York,2005,183-245.[4]Frear DS,Swanson HR,Tanaka FS.N-Demethylation of substituted3-(phenyl)-1-methylureas:isolation and characterization of a microsomal mixed function oxidase from cotton.Phytochemistry, 1969,8(11):2157–2169.[5]Paquette SM,Bak S,Feyereisen R.Intron-exon organization andphylogeny in a large superfamily,the paralogous cytochrome P450 genes of Arabidopsis thaliana.DNA Cell Biol,2000,19(5): 307–317.[6]Murphy PJ,West CA.The role of mixed function oxidases in kaurenemetabolism in Echinocystis macrocarpa Greene endosperm.Arch Biochem Biophys,1969,133(2):395–407.[7]Li LY,Cheng H,Gai JY,Yu DY.Genome-wide identifycation andcharacterization of putative cytochrome P450genes in the model legume Medicago truncatula.Planta,2007,226(1):109–123. [8]Lew FL,West CA.(-)-kaur-16-en-7β-ol-19-oic acid,an intermediatein gibberellin biosynthesis.Phytochemistry,1971,10(9): 2065–2076.1.1.2细胞色素P450结构特征在细胞色素P450超基因家族中，不同成员之间在氨基酸序列上具有高度的变异性，但其空间结构上却保持较高的相似性，P450蛋白三级结构主要由C端的α-螺旋结构和N端的β-折叠结构组成[1,2]。