抑菌活性实验方案
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抑菌活性实验方案
薄层层析(TLC)是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪类、糖脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。
(1) 初始发酵培养基的筛选
在250 mL三角瓶装100 mL基础培养，将种子培养基以6%接种量接入各种基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养5d，测定不同培养基下发酵液对供试病原菌的抑制率，确定最佳基础培养基。
(2) 发酵时间的确定
将活化的种子培养基以6%接种量接入筛选出的基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养不同时间段，测定每个时间段发酵液上清液对供试病原菌的抑制率，确定最佳发酵时间。
(3) 发酵初始pH值的初步确定
将优化后碳氮源的基础培养基的pH分别调成3、5、7、9、11，然后再按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同pH培养基发酵液无菌滤液对供试病原菌的抑制率，确定初始pH范围。
(4) 发酵温度的初步确定
以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6 %接种种子培养基，分别在20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃，170 r/min培养一定时间后，测定不同温度下发酵所得发酵液对供试病原菌的抑制率，确定发酵温度范围。
(5) 发酵接种量的初步确定
以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，分别按2 %、4 %、6 %、8 %、10 %
接种种子培养基，在28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同接种量对发酵液抑菌活性的影响，确定发酵接种量范围。
(6) 发酵转速的初步确定
以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6 %接种种子培养基，28 ℃、以100r/min、130 r/min、160 r/min、190 r/min、210 r/min培养一定时间后，测定不同发酵转速对发酵液抑菌活性的影响。
(7) 发酵装液量的初步确定
以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，在250 mL锥形瓶中装入50 mL、75mL、100 mL、125 mL、150 mL，按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同发酵装液量对发酵液抑菌活性的影响。
(8) 碳、氮源的筛选
碳源优化：分别以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、小米、玉米粉、麦芽糖、燕麦粉和麸皮替换筛选出基础培养基中的碳源，并以缺少碳源的基础培养基为对照；以初始发酵条件进行发酵，测定不同碳源发酵液上清液对供试病原菌的抑制率，确定最佳碳源。
氮源优化：分别以豆饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、牛肉膏和黄豆粉替换筛选出基础培养基中的氮源，并以缺少氮源的基础培养基为对照；发酵条件同碳源优化，测定不同氮源发酵液对供试病原菌的抑制率，确定最佳氮源。
(9) 碳源浓度的初步确定
筛选出的氮源浓度不变，将碳源浓度设置5个浓度梯度，以初始发酵条件进行发酵，测定不同C源浓度发酵液对供试病原菌的抑制率，确定碳源浓度范围。
(10) 氮源浓度的初步确定
筛选出的碳源浓度不变，将氮源浓度设置5个浓度梯度，以初始发酵条件进行发酵，测定不同N源浓度发酵液对供试病原菌的抑制率，确定氮源浓度范围。
3.活性成分分析
薄层层析法
（1）挥发油的检查
首先观察滤纸上有无油迹样斑点，加热烘烤时若油迹消失，证明有挥发油，若未消失，需用试管法进一步确证。为进一步检查，可用石油醚:乙酸乙酯(95:5)展开提取液，喷以新配制 5%香荚兰醛的浓硫酸溶液，如在斑点上出黄色、棕色、红色或兰色反应，表明含有挥发油。
（2）生物碱检查
显色剂：改良碘化铋钾试剂：橙色、棕红色斑点为正反应。
（3）强心甙检查
显色剂：先喷以 2 % 3,5-二甲基苯甲酸乙醇溶液，再喷以 4 %NaOH 乙醇溶液，紫红色斑点，反应后，荧光显著加强为正反应。
（4）黄酮及甙类检查
a、先在紫外灯下观察荧光，再喷以 1 %AlCl3溶液观察荧光是否加强，如原显黄色、黄绿色斑点，反应后，荧光显著加强为正反应。
（5）蒽醌及其甙类检查
喷 5 %KOH 溶剂，如经 90 ℃烘烤 5 min 后显橙黄、橙红、紫红色斑点或色环
为正反应。
（6）甾体类机萜类化合物检查
5 %磷钼酸乙醇溶液喷后 120 ℃烘 5 min，若显兰-兰紫色为正反应。 （7）酯类、内酯、香豆素及其甙的检查
a、使用异羟肟酸铁试剂(包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)时先将Ⅰ:Ⅱ(1:2)混合过滤后，滤液作为显色剂，喷后烘干。在喷以Ⅲ，最后在 80 ℃烘 2 min，若显兰-紫色斑点为正反应。
（8）还原糖的检查
用邻苯二甲酸-苯胺试剂显色，104 ℃烘 5 min，显红-棕色斑点为正反应。
（9）有机酸的检查
a、pH 试纸检查：水提液和醇提液，若显酸性，可能含有游离有机酸或酚类成分。b、0.05 %溴酚蓝乙醇试验：用 0.05 %溴酚蓝乙醇液喷雾，在兰色背景上有黄色斑点即为正反应。
（10）氨基酸检查
0.2 %茚三酮溶液喷后，于 80 ℃烘 10 min 显红、兰、紫色斑点为正反应，亦有少数氨基酸呈黄色斑点。
化学反应检测
1、酚类成分的检试
三氯化铁试验：取酸性乙醇提取液 1 mL 于试管中加入 1～2 滴 1 % FeCl3
醇溶液，若显绿、兰绿或暗紫色为正反应。
2、鞣质检试
石灰水反应：水提液 2 mL 加入新制石灰水数滴，可水解鞣质呈青灰色沉淀，缩
合鞣质产生棕色或红棕色沉淀。
3、生物碱的检试
取 10 mL 酸性乙醇提取液，用 5 % NH4OH 调至中性，水浴上蒸干，加 3 mL
5 %硫酸溶液溶解残渣，过滤后滤液作如下检查：碘化铋钾试验：1 mL 滤液加碘化铋钾试液 1～2 滴，如生成浅黄色—桔红色沉淀为正反应。
4、糖、多糖及甙类成分检试
α-萘酚试验：取 1 mL 热水提取液，加入 5 %α-萘酚试验溶液 2～3 滴，摇匀，沿管壁缓缓加入 0.5 mL 浓硫酸，交界面如很快出现紫红色环，即含有糖类、多糖或甙类，此反应很灵敏，在过滤时注意不可引入纤维或植物材料粉末。
5、皂甙的检试
氯仿-浓硫酸试验：取水提液 2 mL 在水浴上蒸干，用氯仿 1 mL 溶解，转入干燥小试管中，沿壁小心滴入 1 mL 浓硫酸。若氯仿层显红或兰色，硫酸层又绿色荧光，示有甾体皂甙。
6、甾体、萜类成分检试 a、冰醋酸-浓硫酸试验：乙醇提取液 1 mL，水浴上蒸干后用 1 mL 冰醋酸溶解残渣，溶液转入干燥试管，加入 1 mL 醋酐，再滴入 1 滴浓硫酸，试液颜色逐渐由黄-红-紫-蓝(青)-墨绿色的一系列变化，表明有甾醇、甾体甙元或三萜成分。其中甾体颜色变化较
7、黄酮及其甙类检试
醋酸铅沉淀反应：水提液或醇提液 2 mL，滴加饱和醋酸铅溶液，观察有无黄色沉淀。若有沉淀，加至再无沉淀时离心取其上清液，再用碱式醋酸铅试验，观察有无沉淀生成。
8、蒽醌及其甙类检试
醋酸镁试验：取甲醇提取液 1 mL，加入 1 %醋酸镁甲醇溶液 3 滴，若有红色反应表示含有蒽醌及其甙类。
9、强心甙检试
碱性苦味酸试验：取甲醇提取液 1 mL，加入碱性苦味酸试液 1 滴，若有橙色或
橙红色反应，表明含有强心甙。
10、内酯、香豆素及其甙的检试
异羟肟酸铁试验：取甲醇提取液 1 mL，加 10 滴 7 %盐酸羟胺甲醇溶液，滴加
10%KOH 甲醇液至 pH 9，于水浴上加热，冷后再以稀盐酸调 pH3～4，最后滴加 1～2 滴 1%FeCl3乙醇溶液，若有橙红色或紫色反应，表明含有内酯、香豆素甙类。
11、氨基酸、多肽和蛋白质检试
茚三酮试验：取冷水提取液 1 mL，加入 0.2 %茚三酮溶液 2～3 滴，摇匀后在沸水浴中加热 5 min，冷却后，如有兰或兰紫色反应，表明有氨基酸、多肽和蛋白质。
12、挥发油、油脂类检试
挥发油试验：取乙醚提取液 1 mL，置玻璃皿上在室温挥发，如有油状物残渣并有香味或特异性气味，受热时，油状物消失或减少，表明有挥发油成分。
