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固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液A液：二甲砷酸钠•3H2O 4.28g加双蒸水至100mlB液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A、B液以配制0.2M二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M二甲砷酸钠缓冲液Na2HPO4•2H2O 35.6gNa2HPO4•4H2O 53.63gNa2HPO4•7H2O 71.64g100mlB液：NaH2PO4溶液NaH2PO4 24.0g/ NaH2PO4 •H2O 27.6g/ NaH2PO4 •2H2O 31.21g 加双蒸水至100ml二、四氧化饿固定液1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜5内将安踣瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d.2、用0.1M磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液0.1M磷酸缓冲液5ml2%四氧化饿水溶液5ml三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液1、10%多聚甲醛水溶液多聚甲醛2g双蒸水20ml2、固定液配制0.2M磷酸缓冲液50ml25%戊二醛10ml 双蒸水加至100ml10%多聚甲醛水溶液20ml染色液配方一、超薄切片染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液硝酸铅 1.33g柠檬酸三钠 1.76g切片染色时间5-10min 双蒸水30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液醋酸双氧铀2g50%乙醇100ml切片染色时间15-30min（室温），延迟时间or提高温度可加反差NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
二、负染色液1、磷钨酸负染色液（PTA）磷钨酸1-2g双蒸水100ml2、醋酸双氧铀负染色醋酸双氧铀双蒸水3、钼酸铵负染色（AM）钼酸铵2g双蒸水。
电镜材料固定方法
1、固定液固定（固定液体积是固定材料的十倍以上）
3%戊二醛in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存
（取材：先整个材料放入固定液中，之后用锋利的双面刀片分割，不能撕扯材料，分割成小块后1*1mm，置于固定液中，抽气~20min，让材料沉入固定液中）
2、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3、1%锇酸固定in 0.1M PBS，4°C overnight
4、0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
5、乙醇系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）
-80%-90%-95%-100%-100%（每级20-30分钟，不同材料时间不同）
注意：100%乙醇时不要吸干，防止材料干了。
用丙酮置换乙醇：
乙醇：丙酮=1：1，纯丙酮2次，每级20-30分钟
6、丙酮：树脂=2：1，1：1（可以停下了，overnight），1：2 2-3h/级
纯树脂12h，
换纯树脂12h （从进入树脂开始就要防潮！）
7、包埋
8、聚合60°C 24hr
注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in 0.1M PBS Ph 7.2。
扫描电镜
1、收集培养好的新鲜菌体，用1×PBS（pH7.0）或0.9% NaCl漂洗样品2-3次，每次15min ，5000rpm离心3min,去上清；
2、加2.5%的戊二醛溶液1ml,轻摇充分混匀，重悬菌液，4℃固定4h或过夜；
3、5000rpm离心3min,去上清，加入500ul PBS漂洗样品三次，每次15min （可用枪轻轻吹打，然后离心再加入新鲜PBS，混匀离心）；
4、加1%锇酸500ul或适量,摇动充分混匀，固定1-2h；
5、5000rpm离心3min,去上清，加入PBS 500ul漂洗样品三次，每次15min；
6、用梯度浓度（包括20%，50%，80%，100%五种浓度）的乙醇溶液脱水，每种浓度处理10min，5000rpm离心3min；
7、用纯丙酮或100%叔丁醇转换100%乙醇2-3次，即乙醇菌液离心的后，去上清，加200ul纯丙酮4℃放置20-30min,5000rpm离心3min，再加入新鲜纯丙酮。
8、自然风干，密封4℃保存，等待上样。
固定液配方一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液 A 液：二甲砷酸钠•3H 2O 4.28g加双蒸水至100ml B 液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M 二甲砷酸钠缓冲液0.1mol/L 磷酸缓冲液 A 液：Na 2HPO 4溶液 2.84g Na 2HPO 4 / 3.161g Na 2HPO 4 •H 2O / 3.56g Na 2HPO 4 •2H2O /5.363g Na 2HPO 4 •4H2O / 7.164g Na 2HPO 4 •7H2O加双蒸水至100mlB 液：NaH 2PO 4溶液 2.40g NaH 2PO 4/ 2.76g NaH 2PO 4 •H 2O/ 3.121g NaH 2PO 4 •2H 2O 加双蒸水至100ml按下表比例混合A 、B 液以配制0.2M 磷酸缓冲液，加1倍双蒸水即得0.1M 磷酸缓冲液二、四氧化饿固定液 1、2%四氧化饿水溶液将0.5 or 1.0g 装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜内将安瓿瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d. 2、用0.1M 磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液 0.1M 磷酸缓冲液 5ml2%四氧化饿水溶液 5ml 三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液 1、10%多聚甲醛水溶液 多聚甲醛 2g 双蒸水 20ml 2、固定液配制0.2M 磷酸缓冲液 50ml25%戊二醛 10ml 双蒸水加至100ml 10%多聚甲醛水溶液 20ml染色液配方一、 透射电镜正染色液1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液 硝酸铅 1.33g 柠檬酸三钠 1.76g 切片染色时间5-10min 双蒸水 30mlNOTICE:该溶液易与空气中CO 2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃 2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液 醋酸双氧铀 2g 50%乙醇 100ml 切片染色时间15-30min （室温），延迟时间or 提高温度可加反差 NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。
电镜样本制备原理
1.固定：将取下的组织块及时投入
2.5%戊二醛固定液中，以固定细胞的形态。
这一步非常重要，因为固定液可以迅速凝固组织中的蛋白质和核酸，从而保持细胞的原有结构和功能。
2.脱水：将固定好的组织块进行脱水处理，通常使用乙醇或丙酮进行脱水。
脱水可以使组织块变硬，以便于进行后续的包埋和切片操作。
3.包埋：将脱水后的组织块放入包埋剂中，经过加热等处理后，使包埋剂凝固，将组织块固定在其中。
包埋剂的硬度适中，可以确保切片时能够切出较薄的样品。
4.切片：使用超薄切片机将包埋的组织块切成薄片，通常厚度在40-50纳米之间。
切片的厚度和质量对于后续的观察和鉴定非常重要，因此需要非常精细的操作。
5.染色：将切好的薄片放在载玻片上，用染色液进行染色，以增强细胞的对比度和结构细节的可见度。
这一步是为了使细胞的结构更加清晰，以便于在电镜下观察。
6.电镜观察：将染色后的薄片放入电镜中观察，可以使用透射电镜或扫描电镜进行观察。
在电镜下，可以观察到细胞的超微结构和细节，如细胞膜、细胞器、细胞核等。
总的来说，电镜样本制备原理需要经过多个步骤，每个步骤都需要严格的操作和质量控制，以确保最终观察到的细胞结构和功能的准确性。
0.2M磷酸缓冲液一系列PH值的配方：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M）pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml5.8 8.0 92.05.9 10.0 90.06.0 12.3 87.76.1 15.0 85.06.2 18.5 81.56.3 22.5 77.56.4 26.5 73.56.5 31.5 68.56.6 37.5 62.56.7 43.5 56.56.8 49.5 51.06.9 55.0 45.07.0 61.0 39.07.1 67.0 33.07.2 72.0 28.07.3 77.0 23.07.4 81.0 19.07.5 84.0 16.07.6 87.0 13.07 .7 89.5 10.57.8 91.5 8.57.9 93.0 7.08.0 94.7 5.3Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/LNa2HPO4·12H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/LNaH2PO4·H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/LNaH2PO4·2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法申请号/专利号：201010185630本发明公开了一种电镜实验用２．５％戊二醛固定液及其制备方法，包括以下步骤：１、磷酸盐缓冲液配制：Ａ液：磷酸氢二钠＊１２个结晶水７１．６４克加蒸镏水至１０００ｍｌ；Ｂ液：磷酸二氢钠＊２个结晶水３１．２１克加蒸镏水至１０００ｍｌ；将Ａ液３６ｍｌ＋Ｂ液１４ｍｌ配置成０．２ｍｏｌｐＨ７．２的磷酸盐缓冲液；２、固定剂戊二醛配制：将步骤１配置好的０．２ｍｏｌｐＨ７．２磷酸盐缓冲液５０ｍｌ，加入５０％戊二醛５ｍｌ，然后加蒸镏水至１００ｍｌ，加入活性炭２ｇ1、0.2M磷酸缓冲液的配制磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g重蒸馏水加至500ml调pH至7.42、戊二醛固定液0．1M磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液如下（A）（B）（C）25%戊二醛（ml）0.4 1 1.6重蒸馏水（ml）4.6 4 3.40．2M缓冲液（ml）5 5 5戊二醛最终浓度(%) 1 2.5 4配制后的固定液pH应为7.3-7.4。
sem生物样品制备步骤
SEM（扫描电子显微镜）是一种高分辨率的显微镜，常用于观察生物样品的微观结构。
生物样品制备是SEM观察的关键步骤之一，以下是一般的生物样品制备步骤：
1. 固定样品，首先，生物样品需要被固定以保持其原始结构。
常用的固定剂包括乙醛、戊二醛或glutaraldehyde等。
固定样品的方法可以根据具体的样品类型而有所不同。
2. 脱水，固定后的样品需要被脱水以去除水分，通常使用酒精逐渐替代水分。
这个过程需要逐渐提高酒精浓度，最终将样品置于无水酒精中。
3. 干燥，脱水后的样品需要被干燥以去除残留的溶剂。
常用的干燥方法包括自然干燥、临界点干燥或者冻干等。
4. 样品制备，干燥后的样品需要被切割、切片或者表面处理以展示所需的结构。
这可能涉及到金属喷镀以增加导电性，或者使用特殊的切割技术。
以上是一般的SEM生物样品制备步骤，不同类型的生物样品可能需要特定的处理步骤。
在进行SEM观察之前，样品制备的质量对于最终观察结果至关重要。
希望这些信息能够帮助到你。
常规电镜测试须知1.请在实验前一周内到电镜室取样品固定所需固定液2. 2.5%戊二醛4℃避光保存，2周内有效3. 2.5%戊二醛固定后标本4℃保存2月内有效4.*戊二醛请避免超时使用5.请按照要求取材、固定，做好样品标签6.送样品时须按照200元人民币/例样品缴齐押金，样品测试结束、交齐测试费后，退回押金；1)每例透射样品只随机切一张含有若干标本切片的200目铜网，如需要增加切片数量，按100元/张切片、染色。
2)扫描电镜如仅需要喷镀，则制样费按100元/例收取3)透射样品如在制样周期外要求制样，可选择自行处理或250元/例加急处理4)取材不符合要求，电镜室拒收；如因取材、固定问题导致无满意结果，请自行负责。
5)！！超出预约时间30min未到电镜室，按照100元/小时收取费用。
6)！！固定液：透射电镜工作液500μl/例，超出按10元/ml收费。
7)！！每学期寒暑假前1个月停止制样。
8)有疑问请联系工作人员电话：62789057，内线：89057收费标准1指在电镜下观察标本、拍照2CCD数码照片3透射电镜制样的全套！指由已固定样品到观察前所有步骤4指由已固定样品到树脂块5指a提供树脂块切片，b要求切片数量超出一张范围时a指在电镜下观察标本、拍照c扫描电镜制样的全套指由已固定样品到观察前所有步骤d指由已固定样品到干燥e指干燥的不需处理样品单纯喷镀*校外人员开具税务发票，需另加6%的税点。
测试结束后，带电镜室缴款通知到学校办公楼一楼财务室缴费，自带记账凭证或税务发票到电镜室，退回押金。
扫描电镜用于表面观察，结果图示扫描电镜1生物材料表面生长细胞扫描电镜2肾小球结构透射电镜用于观察细胞内部结构，结果图示透射电镜 1肝糖原聚集透射电镜 2 培养细胞常规透射电镜送样须知-培养细胞请按要求取材1)细胞数：106或25ml培养瓶达到生长面积的80%，贴壁细胞使用细胞刮刮下细胞或消化液消化细胞；2)使用4℃的PBS(0.2M pH7.4)或生理盐水对细胞进行离心漂洗2-3次。
扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。
二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。
用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。
三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。
＊整个过程，样品不要暴露于空气。
1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。
四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。
五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。
用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。
玻片过大或者过厚影响观察效果。
2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。
3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。
离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。
样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。
4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。
将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。
（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。
5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。
磷酸盐缓冲液(PBS)a.磷酸盐缓冲液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液0.2M磷酸盐缓冲液的配制将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。
五、电镜标本制作方法电镜标本用于观察组织细胞的超微结构。
扫描电镜用于细胞表面的观察，透射电镜用于细胞内部结构的观察。
现以透射电镜标本的制作为例作简要介绍：(一)取材标本的新鲜程度要求高于光镜标本，组织块小于lmm3。
(二)固定常用的固定液有2．5％戊二醛磷酸缓冲液和1％锇酸。
这些液体穿透力较强，能稳定和保存细胞内的结构。
固定温度应控制在0～4℃，固定时间1~2小时。
(三)冲洗冲洗液由0．2mol／L磷酸缓冲液(pH7.2)与双蒸水等量混合配成。
冲洗组织块2次．间隔15分钟。
(四)脱水脱水剂多采用浓度递增的酒精和丙酮，从50％70％90％酒精1/2 90％酒精+1/2 90％丙酮混合液90％丙酮(以上步骤均在0~4℃冰箱中进行) 100％丙酮，间隔10~15分钟。
(五)包埋包埋剂为环氧树脂618或812和固化剂十二碳烯基丁二酸酐(简称DD-SA)，加入适量增塑剂苯甲酸二丁酯(简称DDP)。
为了使反应速度增快，可加入加速剂2，4，6-三[(二甲氨基)甲基]苯酚(简称DMP-30)。
包埋剂配方：环氧树脂618或812 60％DDSA 40％DBP 3％DMP-30 1％上述试剂依次加入，边加边搅拌，全部加完后再充分搅拌10～15分钟，静置于35~40℃温箱内排出气泡。
包埋前组织块必须浸透，入无水丙酮加等体积包埋剂室温3小时，纯包埋剂37℃2小时。
包埋时先将纯包埋剂倒入胶囊或含硅胶的包埋槽内，置入组织块。
包埋后在60C温箱中烘2～3天后硬化成块，即可剥去胶囊或包埋槽。
(六)将组织块修成塔形，尖端面积为0.2mm×0.3mm左右，用超薄切片机切成50mm厚的超薄切片，再置于铜网上。
(七)染色常用的染液有1~2％醋酸铀和枸橼酸铅。
醋酸铀染色是在组织块进行脱水过程中进行的，而枸橼酸铅染色则多用于片染。
最后，将载有切片的铜网置于透射电镜内观察和摄影。
由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。
固定液的选择和配方：1、缓冲液的配制：在配制固定液之前，应先配制缓冲液。
0.2M磷酸缓冲液的配制：磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29g重蒸馏水加至500ml调pH至7.42 (灌注)固定液的配制4%多聚甲醛用0.2M磷酸缓冲液配制，重蒸馏水补足容积。
4%多聚甲醛+（0.5-2%）戊二醛，以4%多聚甲醛+1%戊二醛为例，配方如下：0.2M磷酸缓冲液的配制 100ml25%戊二醛（电镜专用） 4ml重蒸馏水加到200ml多聚甲醛和戊二醛混合固定液：1.4%多聚甲醛+5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加10 ml 25%戊二醛，再加15 ml 0.2 PB,调pH备用。
此固定液中含多聚甲醛4%，戊二醛5%，属高渗液，但固定效果不错，尤其对细胞内的微管保存较好。
2.2%多聚甲醛+2%戊二醛：溶解1g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加4 ml 25%戊二醛，再加21 ml 0.2 PB,调pH备用。
常规固定选用这种配方。
3.4%多聚甲醛+0.5%戊二醛：溶解2g多聚甲醛于25 ml双蒸水中，80℃水浴，摇动使之溶化后加1-3滴1M NaOH，使溶液澄清。
冷却后加1 ml 25%戊二醛，再加24 ml 0.2 PB,调pH备用。
推荐用作免疫电镜标本固定剂，对于抗原较强的标本，可将浓度降低到2%多聚甲醛+0.25%戊二醛。
注意：多聚甲醛一瓶几十元，电镜专用戊二醛200左右，二者价格差距太大，因此，对于较大的动物要做电镜，灌注固定，则选择4%多聚甲醛+（0.5-2%）戊二醛的混合固定液，这两种固定剂优缺点可以互相补充。
多聚甲醛与戊二醛相比，其渗透力强、固定迅速、价格低廉，它对细胞基质保存不如戊二醛，但对酶的活性保存好。
透射电镜样品制备步骤取材醛类前固定缓冲液漂洗饿酸固定（后固定）缓冲液漂洗脱水剂梯度脱水丙酮/环氧丙烷臵换浸透（先于不同比例包埋剂-脱水剂再纯包埋剂长时间浸透）加热聚合修快超薄切片铀铅染色1、取材：4℃冰块上迅速取材，1mm3大小，立即放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）脑、胰等柔软组织先切成较大厚片于戊二醛固定数分钟增加硬度，再切成小块臵于新的戊二醛固定液小肠、周围神经、肌肉等方向性、易扭曲样本可绑在小波棒上固定，待硬化后纵行方向切成长方形固定2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作）注：饿酸固定时间过长会导致脂蛋白复合体溶解，使组织变脆，不利于切片3、再漂洗：吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察骨组织漂洗后需脱钙，EDTA-2Na脱钙液4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷臵换；Cell的固定脱水无需臵换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，臵换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
植物组织脱水时间延长，100%脱水剂中加入烤干的无水CuSO4、无水Na2SO45、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300 ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
扫描电镜高真空模式新鲜植物样本的前处理一、取材取材动作要轻柔，避免组织挤压和过度伸展；取材要使用锋利的刀，尽量减少对组织的机械性损伤；取材速度要快，取材后立即放入固定液中固定；所取材料表面积应不大于 4 mm × 4 mm和厚度应不大于 3 mm，使得材料可以充分固定、脱水、干燥。
二、固定方法一：戊二醛固定2.5 %（v/v）戊二醛4℃固定大于4 h，磷酸缓冲液（PBS）洗涤3次。
方法二：戊二醛及锇酸双固定2.5 %（v/v）戊二醛4℃固定大于4 h，磷酸缓冲液（PBS）洗涤3次，每次10 min，1 %（m/v）锇酸4℃重固定1~2 h，磷酸缓冲液（PBS）洗涤3次，每次10 min。
方法三：快速冷冻固定将生物材料投入液氮中，快速冷冻可使生物组织细胞的结构和化学组成接近于生活状态。
被冷冻固定的生物样品，可以在表面喷镀薄层金属，并且在低温条件下转移到具有低温样品台的扫描电子显微镜中直接观察。
该方法适合于研究含水量很高的生物材料。
三、脱水乙醇/丙酮梯度脱水30 %、50 %、70 %、85 %、90 %、100 %、100 %乙醇/丙酮浸泡10 min梯度脱水。
四、媒介剂置换（临界点干燥法此步可省略）乙酸异戊酯/叔丁醇置换乙醇/丙酮乙酸异戊酯/叔丁醇置换乙醇/丙酮两次，每次20 min，每次置换后8000 rpm，离心5 min。
五、干燥方法一：空气干燥法将样品从醋酸异戊酯/叔丁醇中取出，放置于干燥钵中干燥2~4 h。
方法二：临界点干燥法将样品从乙醇/丙酮中取出，充入液体二氧化碳，液体二氧化碳置换乙醇，20－60分钟，升温升压达到二氧化碳临界点(31℃, 72.8大气压)，维持4分钟，保持温度和压力并缓慢放出二氧化碳，大约持续30分钟方法三：冷冻干燥法将样品从醋酸异戊酯/叔丁醇中取出，分别于-20℃、-40℃、-80℃冷冻12 h，于冷冻干燥仪中干燥12 h备用。
六、导电处理离子溅射镀膜法将样本固定到导电胶布上，竖直放置到离子溅射仪的样品台上，按照抽真空1 min，离子溅射30 s（）对样本进行离子溅射镀膜。
Leagene 。
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戊二醛固定液(电镜专用,4%)
简介：
固定的目的在于保存细胞和组织的原有形态结构，固定剂能阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长。
固定剂通过凝固、生成添加化合物等使蛋白质内部结构发生改变，从而使酶失活。
戊二醛固定液(电镜专用，4%)由戊二醛、磷酸盐、去离子水等组成，pH7.2～7.4，该固定液对细胞核、细胞浆的细微结构固定效果好，经常用于电镜标本的固定。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验具体要求操作。
2、 取新鲜标本，立即入戊二醛固定液4℃固定，稍大标本应适当延长固定时间。
3、 送检或4℃保存。
注意事项：
1、 Leagene 戊二醛固定液有一定腐蚀性，请在通风较好的环境下小心操作， 避免吸入。
2、 组织取材的厚度不同，固定时间也不同。
常规活检组织比较适合的厚度为2～4mm ，一般不超过6mm 。
3、 温度对固定的影响很明显，提高温度可以加速固定作用，但本固定液最好不要提高温度。
4、 取出新鲜组织后，应及时固定。
无法及时固定时，应保存于生理盐水中及时送检。
5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 6个月有效。
编号 名称 DF0157 Storage 戊二醛固定液(电镜专用,4%) 100ml 4℃ 避光 使用说明书 1份。
扫描电镜
1、收集培养好的新鲜菌体，用1×PBS（pH7.0）或0.9% NaCl漂洗样品2-3次，每次15min ，5000rpm离心3min,去上清；
2、加2.5%的戊二醛溶液1ml,轻摇充分混匀，重悬菌液，4℃固定4h或过夜；
3、5000rpm离心3min,去上清，加入500ul PBS漂洗样品三次，每次15min （可用枪轻轻吹打，然后离心再加入新鲜PBS，混匀离心）；
4、加1%锇酸500ul或适量,摇动充分混匀，固定1-2h；
5、5000rpm离心3min,去上清，加入PBS 500ul漂洗样品三次，每次15min；
6、用梯度浓度（包括20%，50%，80%，100%五种浓度）的乙醇溶液脱水，每种浓度处理10min，5000rpm离心3min；
7、用纯丙酮或100%叔丁醇转换100%乙醇2-3次，即乙醇菌液离心的后，去上清，加200ul纯丙酮4℃放置20-30min,5000rpm离心3min，再加入新鲜纯丙酮。
8、自然风干，密封4℃保存，等待上样。
固定液配方
一、戊二醛固定液:市售戊二醛为25%or50%水溶液，一般用磷酸缓冲液或二甲砷酸盐溶液配制成所需浓度的固定液
0.1mol/L 二甲砷酸钠缓冲液A液：二甲砷酸钠•3H2O 4.28g
加双蒸水至100ml
B液：HCL(36-38%) 1.66ml 加双蒸水至100ml
按下表比例混合A、B液以配制0.2M二甲砷酸钠母液（在通风橱配制），加1倍双蒸水即得0.1M二甲砷酸钠缓冲液
Na2HPO4•2H2O 35.6g
Na2HPO4•4H2O 53.63g
Na2HPO4•7H2O 71.64g
100ml
B液：NaH2PO4溶液NaH2PO4 24.0g/ NaH2PO4 •H2O 27.6g/ NaH2PO4 •2H2O 31.21g 加双蒸水至100ml
二、四氧化饿固定液
1、2%四氧化饿水溶液
将0.5 or 1.0g装四氧化饿安踣瓶充分洗净，放入棕色试剂瓶，在排毒柜5内将安踣瓶敲破，立刻加入双蒸水，配制成2%四氧化饿水溶液，盖上盖子，溶解1d.
2、用0.1M磷酸缓冲液配制成四氧化饿固定液0.1M磷酸缓冲液5ml
2%四氧化饿水溶液5ml
三、karnovsky 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液
1、10%多聚甲醛水溶液多聚甲醛2g
双蒸水20ml
2、固定液配制
0.2M磷酸缓冲液50ml
25%戊二醛10ml 双蒸水加至100ml
10%多聚甲醛水溶液20ml
染色液配方
一、超薄切片染色液
1、柠檬酸铅（Re ynolds’）溶液硝酸铅 1.33g
柠檬酸三钠 1.76g
切片染色时间5-10min 双蒸水30ml
NOTICE:该溶液易与空气中CO2作用而产生沉淀，故使用与保存时，应尽量减少与空气接触，若稍有白色沉淀即舍弃
2、醋酸双氧铀-50%饱和溶液醋酸双氧铀2g
50%乙醇100ml
切片染色时间15-30min（室温），延迟时间or提高温度可加反差
NOTICE:溶液呈鲜黄色，若变淡则表示失效。
二、负染色液
1、磷钨酸负染色液（PTA）磷钨酸1-2g
双蒸水100ml
2、醋酸双氧铀负染色醋酸双氧铀
双蒸水
3、钼酸铵负染色（AM）钼酸铵2g
双蒸水。
