山东大学生物化学精品课程03-2 peptide
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生物化学第三章 蛋白质 Proteins第三节 肽 (peptides)一、肽的定义与肽键 二、肽的书写 三、自然界中存在的小肽 四、肽的理化性质一、蛋白质中氨基酸之间的连接键 是主要的是肽键蛋白质肽链结构学说的证据：肽键是一个酰胺键。
（1）蛋白质水解前后的结果分析。
（2）人工合成的多肽和天然蛋白质，都可被蛋白水解酶水解， 人工合成多肽中氨基酸是肽键连接的。
（3）天然蛋白质有双缩脲反应。
（4）人工合成的聚合aa的X-光衍射谱和红外光谱与天然纤维蛋 白相似。
（5）结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质肽链结构学说的 正确性。
肽键的形成两个氨基酸分子头尾连接起来 NH21COOHCarbodiimideNH2脱水2COOHO NH21C N H2COOHJuang RH (2004) BCbasics肽的结构与肽键二、肽的定义与结构氨基酸借肽键连接的分子叫肽，肽是一大类物质，即：1）两个氨基酸组成的肽叫二肽； 2）三个氨基酸组成的肽叫三肽； 3）多个氨基酸组成的肽叫多肽； 4）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链，肽链两端有 自由-NH2和-COOH，自由-NH2端称为N-末端（氨基末端）， 自由-COOH端称为C-末端（羧基末端）； 5）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基； 6）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH2端开始，由N指 向C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾。
肽的结构分析两端氨基酸 N-C-C-N-C-C-N-C-C α-碳为中心 N-C-C-N-C-C-N-C-C 单位小分子 N-C-C-N-C-C-N-C-C 肽键的定位 N-C-C-N-C-C-N-C-Cα α αJuang RH (2004) BCbasics肽的书写写法：从左 右，从N末端 C末端。
三字母用连线，也有用单字母的。
读法：××酰—××酰—… —××酸。
写法： Ser-Gly-Try-Ala-Leu 或SGTAL， 名称：丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸p 轨道电子共振使肽键具双键特性C Cδ- OHN δ+ CJuang RH (2004) BCbasics肽键的特点● 肽键 虽是单键却有双键性质，不能自由旋转 ● 肽键 周围六个原子在同一平面（酰氨平面）上 ● 相邻两个氨基酸的 α-carbon 在对角 (trans)，反式 ● 肽键亚氨基在pH 0-14内不解离。
αNCsp2sp2C ON CαHCPro形成的肽链肽平面是可以反式也可以顺式。
以肽键平面连接成多肽长链两肽键 平面的交接点为 α-碳 注意 α-碳上面接有各种大小不等的基团Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.136氨基酸残基氨基酸残基多肽链可以看成由Cα串联起来的数个酰胺平面组成三、肽的物理化学性质1、 旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。
2、 肽的酸碱性质– 短肽在晶体和水溶液中是以偶极离子形式存在。
– 肽的酸碱性质主要取决于N端α-NH２和C端α−COOH 以及侧链R上可解离的基团。
– 在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。
3、肽的等电点：pH 优势离子的净电荷： <3.5 +2 3.5-4.6 +1 等电点： 4.6-7.8 0 7.8-10.2 -1 >10.2 -24.6 + 7.8 pI = = 6. 2 24、肽的化学反应 肽的α-羧基，α-氨基和侧链R基上的活性基团 都能发生与游离氨基酸相似的反应。
双缩脲反应 NH2-CO-NH-CO-NH2 ( 双 缩 脲 ） ， 能 与 CuSO4-NaOH产生颜色反应。
凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩 脲反应，可用于定量分析。
双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应， 游离氨基酸无此反应。
四、天然存在的活性肽1、 谷胱甘肽（GSH） 三肽（Glu-Cys-Gly），广泛存在于生物细胞中，含 有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还 原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使 其处于活性状态。
H2 C H2 CHOOCCH NH2COHNCH CH2 SHCOHNCH2COOHγ-肽键GluCysGlyγ β α2.促甲状腺素释放激素：三肽（焦谷氨酰组氨酰脯 氨酸），可促进甲状腺素的释放。
3.短杆菌素S：环十肽，含有D-苯丙氨酸、鸟氨酸， 对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。
4.青霉素：含有D—半胱氨酸和D—缬氨酸的二肽衍生 物 。
主要破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引起溶菌。
5.牛催产素与加压素：均为九肽 6.舒缓激肽：促进血管舒张，促进水、钠离子的排出。
7.脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用。
氨基酸意义：1、研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质结构与功能的基础，这是因为Pr的一级结构决定了它的高级结构，从而决定了蛋白质的生物功能。
2、一级结构的研究为生物进化提供了依据，不同生物的同一种蛋白的其一级结构是不同的。
3、一级结构的研究为一些分子病的诊断提供了依据。
只有将蛋白质的一级结构研究清楚后，生化工作者才能站到一个优越的地位去洞察，研究生命过程中的许多复杂问题。
Nelson & Cox (2000) Principles of Biochemistry (3e) p.142S SOOCQG I V E QC C T S I C S L Y L E N Y C NCOOF S F V N Q H L CGH L V EA L Y L V C GE R G FY TP K T NO 2S S S S SS +NH NH OOC Q G I V E Q C C T S I C S L Y L E N Y C N COO -F S F V N Q H L C G H L V E A L Y L V C G E R G F Y T P K T B-chain +NH OOC Q G I V E Q C C T S IC S L Y L E N Y C N COO F S F V N Q H L C G H L V E A L Y L V C G E R G F Y T P K T B-chain COO -F L Y LV C G E R G FY T P K T S F V N Q H L C G H L V E A B-chain2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定① N-末端分析 A.化学法DNS-Cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多 肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色 DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层 析、薄层层析、液相等。
PITC法：Edman法，逐步切下。
无色PTH-氨基酸，有 机溶剂抽提，层析。
2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定① N-末端分析 B.酶 法（氨肽酶法） 从多肽链的N-末端逐个地向里切。
根据不同的 反 应 时 间 测 出 酶 水 解 所 释 放 的氨基酸种类和数 量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线。
亮氨酸氨肽酶：最常用 氨肽酶M：较常用 Gly-Ser-Val2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定① N-末端分析 C.常见问题及处理方法：经常碰到N-末端残基的氨基被封闭。
因此不能与 Edman降解试剂发生作用。
焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。
焦谷氨酸氨肽酶O O N HenzymeO NH peptide O N H+ NH2OHpeptideCC2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定② C-末端分析 A.肼解法无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。
苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。
Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定② C-末端分析 B.还原法, 硼氢化锂(LiBH4)肽-COOH 生成肽-CH2OH 水解,分离,层析鉴定。
此法比较少用。
C.羧肽酶法，（Pro不能测）羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a 羧肽酶B：只水解Arg、LysVal—Ser—Gly3、肽链的分离、纯化与测定①.多肽链之间的连接方式 A.共价键二硫键 酰胺键 酯键 -S-S-CO-NH-CO-O-B.非共价键氢键 离子键 疏水作用 范德华力 R……H R+……RR R R R共价键或非共价键的键能键 共价键 离子键 氢 键长真空中 90 80 4 0.1水溶液 90 3 1 0.1 kcal/mole0.15 nm 0.25 nm 0.30 nm 0.35 nm范德华力Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.573、肽链的分离、纯化与测定②.肽链的拆离方法 A.二硫键的拆离过甲酸氧化法和巯基化合物（巯基乙醇）还原法。
B.非共价键的拆离8M 尿素或6M 盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散而 成无规则的构象。
C.烷基化试剂保护如碘乙酸保护还原-SH，防止重新氧化。
4、肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般是100-1000个氨基酸，需要 将其切成小肽段，分别测定它们的顺序，最后连在一起。
1、裂解的部位要专一。
2、裂解点要少，切的肽段的大小要合适。
3、产率要高，要求试剂不能破坏裂解后的肽段。
裂解的方法：化学法，酶学法4、肽链的部分水解①、化学裂解法 A.溴化氰裂法：专一裂解Met羧基所成的肽键甲基硫氰酸4、肽链的部分水解①、化学裂解法 B.羟胺断裂：专一裂解Asn-Gly之间的肽键。
专一不很强，Asn-Leu,Asn-Ala键也部分裂解 由于Asn-Gly出现机率较低，所以所得片断较大。
4、肽链的部分水解②、酶裂解法 A.胰蛋白酶( trypsin )专一裂解Lys、Arg的羧基参与形成的肽键。
为了 减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保 护起来，1.2－环己酮封闭Arg，马来酸酐封闭 Lys。
氮丙啶形成带正电荷点，增加位点。
B.糜蛋白酶(Chymotrypsin)断裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽 键。
断裂键邻近的基团，碱性：裂解能力↑， 酸性：裂解能力↓OH O C CH NH2 H2 C H2 C H2 C NH C NH2 ON+ H2 O环已二酮OH O C CH NH2 H2 C H2 C H2 C NH C NHN+HOH O C CH NH2 H2 C H2 C SH OOH C CH NH2 H2 C S H2C H2 C NH2+H2 CNH+H+4、肽链的部分水解②、酶裂解法 C.胃蛋白酶(Pepsin)断裂键两侧的殘基都是疏水性或芳香氨基酸残 基。
