利用专家系统评估多菌灵杀菌剂的安全性

刘超，林文锋，程树军（广东出入境检验检疫局，广东　广州　５１０６２３）摘　要：农药健康及环境风险评估的不确定性，主要是由于缺乏关于母体化合物吸收、分布、代谢、降解的实验数据。

考虑到动物福利和成本效益等因素，充分利用计算机模型和体外测试等替代方法进行预测是一条可行的途径。

本文研究在多菌灵的毒性评估中，利用非生物测试法模拟和预测了微生物和哺乳动物的代谢途径和代谢产物；识别生物转化产生的代谢物；深入了解了模拟代谢反应和代谢反应发生的可能性机制。

结果表明，基于算法的专家系统可以作为农药评估的一种方法，在进一步提高其稳健性后，有希望用于法规目的。

关键词：专家系统；多菌灵；计算机方法；替代方法中图分类号：Ｓ４８２．２ 文献标志码：ＡＳａｆｅｔｙ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ　Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｂｙ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　ＡｎａｌｙｓｉｓＬｉｕ　Ｃｈａｏ，　Ｌｉｎ　Ｗｅｎ－ｆｅｎｇ，Ｃｈｅｎｇ　Ｓｈｕ－ｊｕｎ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｅｒ，　ＧｕａｎｇｄｏｎｇＧｕａｎｇｚｈｏｕ　５１０６２３）Abstract:Ｔｈｅ　ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ　ｏｆ　ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｒｉｓｋ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｉｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌａｃｋ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄａｔａ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｒｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ．　Ｔａｋｉｎｇ　ｉｎｔｏ　ａｃｃｏｕｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ａｎｉｍａｌ　ｗｅｌｆａｒｅ　ａｎｄ　ｃｏｓｔ－ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ，　ｉｔ　ｉｓ　ａ　ｖｉａｂｌｅ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｆｕｌｌ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｍｏｄｅｌｓ　ａｎｄ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｔｅｓｔｉｎｇ．　Ｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，　ｎｏｎ－ｂｉｏａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍｏｄｅｌ　ａｎｄ　ｐｒｅｄｉｃｔ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ａｎｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　ｍａｍｍａｌｓ；　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ；　ｔｏ　ｇａｉｎ　ｉｎｓｉｇｈｔ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．　Ｔｈｅ　ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｉｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ－ｂａｓｅｄ　ｅｘｐｅｒｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｈｏｐｅｆｕｌｌｙ　ｆｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｕｒｐｏｓｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｉｔｓ　ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ．Key words：Ｅｘｐｅｒｔ　ｓｙｓｔｅｍ；　Ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ；　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｍｅｔｈｏｄ；　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ植物保护剂的广泛使用带来了严重的农药残留问题，农药的健康风险和环境风险评估，不仅要考虑农药残留物本身，还要考虑包括环境生物中的代谢、降解及反应产物，如哺乳动物、禽类、家畜、植物内的代谢物数据和环境归宿（包括土壤、水/沉积物中的微生物降解）数据以及毒性数据，这些信息需要大量的试验支持。

考虑到动物福利和成本效益等因素，充分利用包括计算机模型和体外测试在内的替代方法是一条可行的途径。

一些模拟新陈代谢的计算机方法，如基于知识的毒性定性预测系统（Derek）、基于结构参数集的优化方法（OASIS TIMES）和化学物质生物活性预测（PASS）等，已陆续应用于化学物质及其代谢产物毒性的预测[1]。

本文以多菌灵为例，用2种计算机专家系统预测微生物和哺乳动物新陈代谢产生的潜在代谢物，用于健康危害评估[2-4]。

基金项目：广东省科技计划农业公关项目“基于体外毒理学模式的农产品低残留危害物风险评估与应用”作者简介：刘超（1976），男，广东潮州人，本科，工程师，研究方向：商品质量安全。

第1期·51·刘超等：利用专家系统评估多菌灵杀菌剂的安全性１　多菌灵杀菌剂模拟１．１　多菌灵杀菌剂的特点多菌灵是甲基苯并咪唑-2-氨基甲酸酯或2-（苯并咪唑基）氨基甲酸甲酯（IUPAC）的通用名称，它是一种使用范围广的内吸性杀菌剂，属于高选择性苯并咪唑类化合物，主要用于收割前后或者储存植物的病害防治，能有效抵制多种子囊菌、担子菌类和半知菌类。

欧盟2006/135/EC第一次把多菌灵列入批准使用的植物保护剂指令附件Ⅰ内。

欧洲食品安全局（EFSA）重新对多菌灵进行了评估。

EFSA审查了多个数据的变化差距，其中包括紫外光谱、溶解度、电离常数、土壤中的好氧生物降解途径等方面的评估。

为了探索用代谢模拟工具来填补数据差距的可能性，有人用化学反应活性和化学归宿软件工具CRAFT Explorer v1.0模拟了多菌灵的生物降解途径，预测其有多种潜在代谢物。

对于多菌灵的哺乳动物代谢已有大量文献报道，利用这些数据，可对现有的预测工具（如Meteor 12.0.0和OECD QSAR应用工具箱2.0）中关于代谢模拟的适用性进行评估。

苯并咪唑杀菌剂的作用方式主要依靠彻底亲和真菌微管（β微管蛋白亚单位）破坏其增殖过程，如有丝分裂纺锤体的形成、核分裂、细胞骨架形成。

对于不同的有机体，苯并咪唑杀菌剂的选择性毒性及其相对效力有很大不同，主要取决于化学品本身，及所作用的微管蛋白的结构和亲和作用。

但是苯并咪唑的也会对其他真核细胞产生毒性作用，例如引起植物染色体畸变、改变叶绿体的光合作用、影响萌芽和幼苗生长、破坏其他生理过程，改变植物细胞代谢，导致植物形态发生变化。

苯并咪唑杀菌剂会被土壤有机质集中吸附，被非目标植物吸收导致对作物产生有害影响。

此外，苯并咪唑杀菌剂对于哺乳动物的毒性也备受关注，因为多菌灵不仅作为母体“活性”成分，而且还是苯菌灵[1-（正丁胺基甲酰）苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯]和甲基硫菌灵的代谢产物。

哺乳动物毒性试验表明，多菌灵具有一些毒性特点，如对皮肤、可引起皮肤致敏，大鼠的短期毒性试验表明可导致肝重量增加、睾丸重量减轻、无精子症和体重减轻等。

由于对有丝分裂纺锤体蛋白干扰的原因，多菌灵可导致（体内和体外的）染色体数目畸变，但是不会导致基因突变或者染色体畸变。

大鼠和兔的经口发育毒性试验证明多菌灵是一种发育毒剂和致畸剂。

基于上述研究，多菌灵的分类标识为致突变原Cat.2（R46）和生殖Cat.2（R60-61），同时提议其为R43（与皮肤接触可能会导致过敏）。

在代谢物的毒性方面，多菌灵乙酸可代谢为2-AB（氨基苯并咪唑），研究表明后者急性毒性比母体更剧烈，而短期毒性相同。

多菌灵可能是来自苯菌灵杀菌剂的代谢产物，通过分裂正丁胺基甲酰母体侧链产生。

它可由甲基硫菌灵形成，通过硫脲基甲酸酯分裂，硫分裂然后环化形成咪唑部分。

多菌灵的毒性与相关前体的毒性相比时，得出以下结论：（1）与苯菌灵相比，多菌灵的急性毒性与之相同，短期毒性和长期毒性都更高，生殖、发育毒性相同；（2）与甲基硫菌灵相比，多菌灵的急性和长期毒性相同，短期、生殖和发育毒性更高[5]。

１．２　用ＣＲＡＦＴ模拟多菌灵的生物代谢１．２．１　ＣＲＡＦＴ法和模型设置为了填补科学数据的不足，使用CRAFT Explorer v1.0软件进行多菌灵生物降解途径的模拟。

该软件由分子网络股份有限公司开发，源自明尼苏达大学生物催化和生物降解数据库（UM-BBD）的各种不同环境反应类型的知识库。

简单来讲，为了预测多菌灵的化学反应性和归宿，应把多菌灵参与的一系列降解反应及其可能得到的产物集中在一起，构建模拟降解途径作为基础，然后用CRAFT Explorer生成所有从多菌灵开始一直到代谢终点之间一切能想到的反应，最终生成三个预测的变量：（1）一个适用于估算的概率模型；（2）取消进一步降解时的标准；（3）概率阈值。

CRAFT Explorer概率模型由几个反应规律、反应类型和分配给各个规律的概率种类构成。

反应类型是对化学转化的一般定义，提供反应形式并注明必要的子结构特性和转化定义。

反应规律执行某个反UM-BBD概率模型是一种生物转化规律模型，用于评定生物降解反应规律时，充分考虑了氧气、土壤（湿度适中）或者水体、pH值（中性）、温度（25℃）、无竞争性或者有其他有毒的化合物这些反应条件。

在模拟生物降解树图中，用下列分配给每个反应规律的模型种类估算规定条件下每种已确认的反应类型的可能性：（1）极有可能发生的反应，即肯定发生、最优先发生的反应；（2）很可能发生的反应，即几乎所有微生物都能催化，并与存在于分子里的功能团发生特定反应时使用；（3）中性，适用于那些常见的，但在每个模拟系统中并不一定会发生的反应。

例如，由于每个基质的原因，有些极可能发生的反应可能会，也可能不会发生，这需要逐案调查。

根据UM-BBD概率模型预测，得到多菌灵生物降解模型的概率阈值设置如下：0～0.2表示不会发生的反应（红色）；0.3～0.4表示不太可能发生的反应（橙色）；0.5～0.6表示可能发生的反应（黄色表示0.5，浅绿色表示0.6）；0.7～0.8表示很可能发生的反应（绿色）；0.9～1.0表示极有可能发生的反应（深绿色）。

接下来是运行CRAFT Explorer模拟程序，前提是要知道发生的反应量、生成的产物量以及生物降解的步骤数量，如生物降解层数，在模拟程序运行时，软件会把这些因素都考虑在内。

假如降解步骤增加，所要确认的产物的数量也相应增多，因为要重复提交所有分子（如在各个降解层生成的产物）。

为了有效运行多菌灵生物降解模拟程序，应选择步骤的最大数（如5）使模拟运行最为彻底。

最终生物降解模拟前的最后一步是选择总概率阈值。

根据CRAFT Explorer的解释，反应产物的总概率可以定义为降解树图中之前所有产物中产生其中一种产物的概率，如图1所示选择总概率阈值可以让CRAFT生成不太可能产生的产物减少。

阈值越大，软件要确定的产物越少。

假如阈值设置为0.6，则CRAFT Explorer没有生成总图１　ＣＲＡＦＴ总概率阈值的定义１．２．２　多菌灵生物降解树图图2的生物降解树图直观地说明了多菌灵及其代谢物的整个过程，包括产生每个已确定的降解产物的所有降解路线。