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指导与应用手册· 1亲水作用色谱 HILIC实用指南指导与应用手册2 · HILIC实用指南亲水作用色谱(HILIC)实用指南原著作书名:A Practical Guide to HILIC原著作者:Patrik Appelblad, Tobias Jonsson, Einar Pontén, Camilla Viklund and Wen Jiang中文版编辑：Wen Jiang (江文）ISBN 978-91-631-8370-6瑞典SeQuant AB出版, 地址: Box 7956, 907 19 Umeå, Sweden.版权所有© 2005-2008, SeQuant AB2008年2月第一版，第一次印刷，瑞典于默奥(Umeå)修订及额外资料可以在Merck SeQuant公司网页上找到，网址。
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HILIC实用指南–指导与应用手册引言本手册旨在介绍一种适用于分析强极性和强亲水化合物的液相色谱分析方法–亲水作用液相色谱(H ydrophilic I nteraction Li quid C hromatography，HILIC)。
主要介绍HILIC的基本理论和该分离模式下的一些实际问题，同时给读者介绍瑞典SeQuant 公司的ZIC ®-HILIC(硅胶基质)和ZIC ®-p HILIC(聚合物基质) 两性离子液相色谱柱(见图1)，以及使用这两种色谱柱分析不同类型亲水化合物的应用实例。
您也会从本手册中获得该类色谱和其他方面的色谱知识。
图1 ZIC ®-HILIC和ZIC ®-p HILIC两性离子固定相的官能团如果本手册不能解决您的HILIC 问题，SeQuant愿为你提供进一步帮助。
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HILICpakVG-504E柱子使用说明
1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。
温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此，在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。
否则反冲会迅速降低柱效。
4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。
有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
亲水多孔硅胶色谱柱柱床填充：亲水多孔硅胶（HILIC）色谱柱以其独特的分离机制在色谱领域得到了广泛的应用。
它是一种新型的色谱柱填充材料，能够有效地分离亲水性物质，广泛适用于分析和生物药物制剂的固定相。
亲水多孔硅胶填充物的独特性能使其在分析和制备中具有重要的应用价值。
亲水多孔硅胶色谱柱由一种多孔性硅胶基质组成，具有大的表面积和优异的亲水性能。
柱床填充物的多孔结构可以提供更大的分析表面积，使样品充分与固定相接触，有利于分析物的吸附和分离。
亲水多孔硅胶材料的亲水性能可以与溶液中的亲水性溶剂相互作用，从而实现分析物的选择性分离。
分离机理：亲水多孔硅胶色谱柱的分离机理是基于静电和极性相互作用的。
亲水性化合物在亲水多孔硅胶上发生吸附，而疏水性化合物则迅速通过柱床。
这种分离机理可以用于分离多种亲水性物质，如醇类、酚类、胺类等。
应用领域：亲水多孔硅胶色谱柱在药物分析、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用。
在药物分析中，亲水多孔硅胶色谱柱可以用于分离和定量分析亲水性物质，如抗生素、植物提取物等。
在环境监测中，亲水多孔硅胶色谱柱常用于分离和测定水中的有机污染物，如酚类、抗生素、农药等。
在食品安全领域，亲水多孔硅胶色谱柱可以用于检测食品中的添加剂、农药残留等亲水性物质。
优点：亲水多孔硅胶色谱柱具有以下几个优点。
首先，它的静电和极性相互作用机理适用于各种类型的亲水性化合物分离。
其次，亲水多孔硅胶色谱柱具有优异的选择性和分离效能，能够有效地分离复杂样品。
此外，亲水多孔硅胶色谱柱具有较大的样品容量和较好的重复性，可满足分析研究的需要。
总结：亲水多孔硅胶色谱柱是一种用于分离亲水性物质的重要工具，其独特的分离机理和优异的性能在多个领域得到了广泛的应用。
随着科学技术的不断发展和进步，亲水多孔硅胶色谱柱的分离效能和选择性还将进一步提高，为各种样品的分离和分析提供更好的解决方案。
亲水作用（H i l i c）色谱，有时被称为“含水正相色谱”，有时又被称为“反反相色谱”，简单来说，是极性的固定相和极性的流动相组成，参考表1，在固定相方面，看似和正相色谱一样，那么，同一款色谱柱是否既可以用于正相色谱，又可以用于H i l i c色谱？在流动相方面，和反相色谱接近，那两种模式保留行为和流动相对保留的影响规律有什么差异？你对H i l i c色谱是否也疑惑重重？接下来让我们一起揭开亲水作用（H i l i c）色谱的神秘面纱吧。
表1 反相、正相、Hilic色谱对比一、Hilic简介1.1流动相在大多数的Hilic分离中，采用的流动相为含有少量水/缓冲液与有机相混合（典型的是乙腈），水的比例为3%-40%之间。
水的比例不低于3%是由于Hilic色谱的保留机理决定的，普遍认为Hilic色谱流动相中的水会被吸附到极性固定相的表面形成水膜，然后分析物在水膜和流动相之间进行液液分配作用，加上极性官能团和固定相之间的氢键作用力，离子官能团之间的静电作用力等，实现被分析物的保留。
水膜的作用非常重要，所以Hilic流动相中至少含有3%的水。
当水的比例大于40%时，保留一般很弱（k≈0）。
1.2固定相应用于Hilic色谱的固定相有：纯硅胶柱、氨基柱、二醇基柱、酰胺基柱等。
纯硅胶柱有固定相不易流失的优点，在使用CAD、ELSD和LC-MS检测器时，最受欢迎；氨基柱，在Hilic 色谱中的应用，特别适合碳水化合物（糖类）分离；二醇基柱，亲水性很好，可以提供不同的选择性。
二、Hilic和正相色谱相比2.1固定相的区别同样是Silica，NH2，Diol柱，与用于正相色谱中的色谱柱不同，专为Hilic色谱设计的色谱柱，可以用于水/有机物的流动相中，换句话说，Hilic色谱对固定相的耐水性要求更高，否则会因固定相的水解，出现基线噪音大、色谱柱寿命短等问题。
所以用于正相色谱中的色谱柱，不一定能用于Hilic色谱。
亲水作用（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。
本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的进行了总结。
1. HILIC的概念亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。
它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。
而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。
2. HILIC的分离机制HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。
更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。
影响保留的主要因素普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。
影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显着增加样品的保留因子。
在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。
一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显着的亲水作用。
如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。
Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid.4. HILIC与RP-HPLC的比较传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。
HILIC色谱柱简介：1. HILIC的概念亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。
它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。
而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。
2. HILIC的分离机制HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。
更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。
”HILIC方法开发经验大披露：1. HILIC色谱柱的以waters 公司的HILIC色谱柱为例，分为HPLC和UPLC两种类型，又分为Atlantis，Xbridge，Acquity三个品牌。
填料类型分为BEH，无封尾和Amide填料三种。
2. HILIC色谱柱的应用范普通反向色谱难以保留的物质。
3.HILIC的对化合物的保留原理：亲水性吸附，离子交换和氢键作用。
应用小TIPS：1.HILIC柱如何平衡？HILIC柱使用70%的乙腈水溶液平衡。
2.HILIC柱如何保存？HILIC柱使用90%的乙腈水溶液保存。
前言：1. 一直使用Waters 的HILIC较多，感觉质量还行，但是要小心waters 的HILIC是分两种类型的填料的BEH HILIC和HILIC。
很多waters 的销售都不清楚之一点。
但是大家一定要注意，这两款的区别是很大的，保留的效果是不同的。
2. 费罗门公司的HILIC柱，感觉是小家碧玉型的，保留能力不是太强，但是清秀文雅，峰型很好看。
3. HILIC的流动相推荐使用乙腈。
4. 推荐使用乙酸铵，这也以后再说。
5.不能使用100% 的乙腈，推荐使用到95%就行了。
不能使用60%一下的乙腈。
所以梯度范围小。
但是足够用了。
因为100%的乙腈可能对HILIC的中亲水的部分不利于键合相的伸展开。
TSKHILICAFCHICIEX系列色谱柱使用冲洗方法色谱柱的冲洗方法对于保护色谱柱、延长使用寿命、提高分离效果至关重要。
下面将分别介绍TSKHILIC、AFC、HIC和IEX系列色谱柱的冲洗方法。
1.TSKHILIC色谱柱的冲洗方法：a.初次使用：先用纯水冲洗柱床两倍柱床体积，以去除柱内可能存在的盐离子和有机溶剂。
b.然后，使用10-20mL纯水/乙醇（80:20，体积比）洗脱样品洗涤剂残留物，同时保护柱内填料。
c.最后，使用纯水冲洗柱床两倍柱床体积，以去除柱床中可能存在的溶剂残留物。
2.AFC色谱柱的冲洗方法：AFC（Affinity Chromatography）色谱柱是一种亲和色谱柱，常用于分离具有特定亲和性的分析物。
以下是一种常用的冲洗方法：a.初次使用：先用公认的吸附剂（如硫酸铵）溶液冲洗柱床两倍柱床体积，以平衡柱内填料，并去除可能存在的污染物。
b.然后，使用适宜pH值的缓冲液（如磷酸缓冲液）进行冲洗，以去除填料和样品中的杂质。
c.最后，使用缓冲液冲洗柱床两倍柱床体积，以达到柱床的稳定状态。
3.HIC色谱柱的冲洗方法：HIC（Hydrophobic Interaction Chromatography）色谱柱是一种疏水相色谱柱，常用于分离疏水性物质。
以下是一种常用的冲洗方法：a.初次使用：先用有机溶剂（如乙醇）冲洗柱床两倍柱床体积，以去除柱内可能存在的水分和杂质。
b.然后，使用含盐缓冲液进行冲洗，使样品组分与填料发生疏水相互作用，以达到最佳分离效果。
c.最后，用纯水冲洗柱床两倍柱床体积，以去除盐离子和有机溶剂残留物。
4.IEX色谱柱的冲洗方法：IEX（Ion Exchange Chromatography）色谱柱是一种离子交换色谱柱，常用于分离带有不同电荷的离子。
以下是一种常用的冲洗方法：a.初次使用：先用纯水冲洗柱床两倍柱床体积，以去除柱内可能存在的杂质。
b.然后，使用合适的缓冲液（含有对应离子交换基团的缓冲液）进行冲洗，以保持样品组分在填料上的稳定吸附。
亲水作用色谱(HＩLIＣ)就是近年来色谱领域研究得热点之一。
本文简介了HＩＬIC得起源、定义、分离特点；比较了ＨIＬIC与反相色谱（RＰＬC）得选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术得特点,并对其使用中得注意事项进行了总结.ﻫ1、HIＬIC得概念亲水色谱（ＨILIＣ)就是一种用来改善在反相色谱中保留较差得强极性物质保留行为得色谱技术。
它通过采用强极性固定性,并且结合高比例有机相/低比例水相组成得流动相来实现这一目得.而这样得流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（EＳI-MS）得灵敏度。
ﻫ２、HＩLIC得分离机制ﻫHＩLIＣ得分离机理在目前还存在着争议,主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换(3)偶极—偶极相互作用。
更多得试验现象则表明HIＬIＣ得保留机理包含氢键作用、偶极作用与静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来.３、ＨILIＣ影响保留得主要因素普遍认为ＨILIC保留行为受到多种参数得影响，如固定相得官能团、有机改性剂得含量、流速、柱温、流动相缓冲体系得pH值、缓冲盐得种类与浓度。
影响样品在固定相上得保留行为得最主要因素都就是流动相中有机相得比例，例如乙腈得含量得增加会显著增加样品得保留因子。
在ＨILＩC分离模式中,溶剂洗脱能力由弱到强为:四氢呋喃＜丙酮<乙腈〈异丙醇<乙醇<甲醇＜水，流动相中水就是最强得洗脱溶剂。
一般采用乙腈—水体系作为流动相,其中水相得比例为5％-40％以保证其显著得亲水作用.如图1所示,将流动相中得水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性得减小,待测物在柱上得保留就会增强。
Figure１、ＨILＩC ｒｅtenｔion as aｆｕｎｃtｉoｎof polar ｍodｉfier、１00 ｍm lenｇｔh AＣQＵＩTY UPLC BEH HILICｃolｕmｎ、Peakｓ：1= metｈacｒyl ｉc acｉd, 2 = cｙｔosinｅ，3 = nortripｔｙlｉne, 4 = nｉｃｏtinｉcａcid、4、HILIC与RP－ＨPＬC得比较ﻫ传统得反相色谱（RPLＣ）对强极性与亲水性得小分子物质得保留与分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例得水相才能实现其保留,然而高比例得水相会导致一系列问题，比如固定相得反浸润与ＥＳI－MＳ灵敏度得下降。
hilic色谱柱新柱子活化解释说明以及概述1. 引言1.1 概述HILIC（Hydrophilic Interaction Chromatography）色谱是一种高效液相色谱分析技术，其特点是利用极性固定相与水样品间的亲和作用进行物质的分离。
随着科学研究和实际应用的需要，近年来出现了许多新型的HILIC色谱柱子。
本文将重点介绍这些新柱子的活化解释以及给出相关概述。
1.2 文章结构本文将按照以下结构进行论述：首先，将对新型HILIC色谱柱子的概述进行介绍；接着，会详细解释新柱子的活化原理；然后，探讨这些新柱子在不同领域中的应用领域和意义；其次，进行性能分析，包括分离效能评估、色谱峰形态分析和保留机制研究；最后，提供关于优化操作方法和操作指南。
1.3 目的本篇文章旨在向读者介绍最新发展的HILIC色谱柱子，并深入探讨这些柱子在实际应用中的优势及性能。
通过阐明它们的活化解释和特点，目的是帮助读者更好地理解和运用新柱子，从而推动HILIC色谱技术在分析领域的发展，并为相关研究人员提供操作指南和优化方法。
2. hilic色谱柱新柱子活化解释说明:2.1 hilic色谱柱概述HILIC（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography）即亲水性相互作用液相色谱，是一种基于极性分离机制的液相色谱技术。
和传统的反相色谱技术不同，HILIC色谱使用亲水性固定相，通过样品中化合物与固定相表面上的极性官能团间的疏水效应进行分离。
HILIC色谱在极性化合物、水溶性小分子药物和多肽等方面表现出优异的分离能力。
2.2 新柱子活化原理hilic色谱柱新柱子活化是为了提高柱子表面亲水性而进行的一系列处理步骤。
新柱子在经过特殊处理后，能够形成更精细的涂层结构，增加其极性官能团暴露在表面上，从而提高柱子表面对样品中目标化合物的吸附能力。
具体来说，在hilic色谱柱新柱子活化过程中，可以采用各种方法来调整和改变固定相表面的组成和结构。
HILIC色谱柱使用注意事项HILIC（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography）色谱柱是一种水合作用液相色谱技术，适用于极性化合物的分离和分析。
使用HILIC色谱柱需要注意以下几个方面：1.样品准备：在使用HILIC柱之前，需要确保样品是水溶性的或能够在水溶剂中溶解。
对于非极性或溶解度低的化合物，可以选择在HILIC之前进行样品前处理，如使用极性溶剂预溶解。
2.流动相选择：HILIC色谱柱适用于极性溶剂，如甲醇、乙腈等。
常见的HILIC流动相为水-有机溶剂的混合物。
选择合适的流动相组成对于有效分离是至关重要的。
一般来说，水的含量越高，极性化合物的保留时间越长。
3.pH控制：HILIC色谱柱在分析过程中可能受到溶剂pH的影响，因此对于一些对pH敏感的化合物，需要进行pH调供更好的保留和分离效果。
4.柱温控制：HILIC柱的温度会影响保留时间和分离效果。
在使用HILIC柱的过程中，需要控制柱温，一般常见的温度范围为20-40℃。
不同样品性质和分析需求可能需要不同的柱温设置。
5.柱平衡：新购买的HILIC柱在使用前需要进行柱平衡，这可以提供更稳定的保留时间和重复性。
常见的柱平衡方法是使用几个体积的流动相进行洗脱，直到保留时间稳定。
6.注样量控制：合适的注样量可以确保信号的线性范围和峰形状的良好。
通常推荐的注样量为柱的最大负载能力的5-10倍。
如果注样量过多，可能会导致峰形变宽或峰形不对称。
7.柱清洗和保养：使用HILIC柱后，及时进行柱的清洗和保养是重要的。
一般来说，可以使用合适的洗脱剂进行柱的冲洗，以去除残留的样品和杂质。
柱的保养包括存放在干燥、封闭的环境中，避免与相干混。
总而言之，HILIC色谱柱的使用需要注意合适的样品准备、流动相选择、pH控制、柱温控制、柱平衡、注样量控制以及柱的清洗和保养。
只有在正确的操作下，才能获得准确、可靠、重复性好的分析结果。
hilic色谱柱寡糖
HILIC色谱柱是一种亲水性交换色谱柱，用于分离和分析亲水性分子，例如糖类、寡糖。
寡糖是由2-9个单糖单元组成的糖分子，具有重要的生物学功能和应用价值。
在糖类的分析中，HILIC色谱柱常被用于寡糖的分离和定量分析。
HILIC色谱使用极性固定相和较强的有机溶剂作为流动相，通过样品分子与固定相之间的亲水性相互作用来实现分离。
在HILIC色谱柱上，寡糖在流动相中与固定相发生相互作用，不同寡糖之间的亲水性差异导致它们在柱上有不同的保留时间，从而实现分离。
使用HILIC色谱柱进行寡糖分析时，常常需要选择合适的流动相和柱温来优化分离性能。
同时，可以通过检测器测量吸光度、折射率或电导率等来检测和定量寡糖。
总之，HILIC色谱柱是一种常用的分离和分析寡糖的工具，可以提供高分辨率和灵敏度的分析结果。
HILIC柱使用说明及注意事项本柱为两性离子的固定相共价结合于多孔硅胶上。
坚固亲水的两性离子官能团使得柱子更适合于亲水相互作用的液相色谱。
带电分析物和中性两性离子固定相之间的弱的静电相互作用力形成特殊的选择性，特别适合在反相柱上保留差的分析物。
ZIC-HILIC柱作为一种工具，它可以改变甚至增强极性和亲水性物质的选择性和峰的分辨率，例如：糖类、代谢物、酸、碱、有机离子、无机离子、金属络合物、氨基酸、肽、蛋白消化液等等。
柱子的硬件和化学兼容性柱子外壳由不锈钢制作而成，可以在pH 3-8范围内使用，不可使用强的碱性溶液以及NaOH作为洗脱剂，柱温最高可加到70摄氏度。
清洗和再生如果柱后压增强或者选择性发生改变，可以使用下面的清洗步骤：30倍柱体积的双蒸水30倍柱体积的0.5M NaCl30倍柱体积的双蒸水第一步使用双蒸水是为了去除有机溶剂和极性杂质，之后跟一段0.5M NaCl 的冲洗，最后去除盐并用80%乙腈平衡。
保存柱子购买时由80%乙腈及5mM NH4Ac (pH 6.8) 保存，该溶剂也适用于柱子的长期保存。
样品使用溶剂及溶剂强度样品应该溶解在60-80%的有机溶剂中或者最初的流动相中。
水的含量要尽量少，弱亲水溶剂如乙腈是比较推荐的。
在自动进样后推荐使用含5%水的清洗溶剂。
亲水溶剂的相对强度如下：丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水。
流动相的探索为了获得可重复的结果，流动相中至少包含3%的水以确保固定相颗粒的足够的水合作用。
HILIC分离的适宜的缓冲体系为甲酸和醋酸盐，因为它们在较高的有机溶剂中仍有很好的溶解性。
避免磷酸盐以及低溶解性的缓冲盐，防止后者在柱床中沉淀。
大部分的分析物缓冲盐的浓度在5-20mM是比较适宜的，上限在200-300mM，主要取决于盐在洗脱溶剂中的溶解度。
TFA和其它离子对试剂坚决不能使用，因为它们会干扰HILIC的分离机制并抑制质谱信号。
典型的洗脱程序等度洗脱：80：20(v:v)乙腈：醋酸铵-水(5-20mM)或者其它适合的缓冲盐梯度洗脱：90%至40%的乙腈，洗脱时间为20min(2.5%/min)。
hilic色谱柱寡糖hilic色谱柱在寡糖分析中的应用色谱技术作为一种重要的分离技术在许多领域中得到了广泛的应用，其中之一就是在寡糖分析中的应用。
而hilic（Hydrophilic Interaction Chromatography）色谱柱作为一种常用的分离工具，因其对水溶性物质具有较强的保留能力而备受关注。
本文将介绍hilic色谱柱在寡糖分析方面的应用，以及其特点和优势。
一、hilic色谱柱的基本原理和结构特点hilic色谱柱是基于氢键作用的离子交换色谱的衍生物，其分离机制主要是通过溶剂流动模式的改变来调节寡糖的保留和分离。
hilic色谱柱对于带有羟基或氨基的寡糖分子具有较强的保留能力，可实现较好的分离效果。
hilic色谱柱的固定相一般采用亲水性较强的材料，例如对碳链较长的硅胶或磨碎的硅胶。
而流动相则通常选择含有高浓度有机溶剂和高离子强度的缓冲液，用以增加寡糖分子之间的相互作用和保留能力，并实现寡糖的有效分离。
二、hilic色谱柱在寡糖分析中的应用1. 寡糖的定性分析hilic色谱柱在寡糖分析中可以用于寡糖的定性分析。
通过改变流动相的成分和流速，可以控制分离色谱峰的保留时间，进而确定不同寡糖的特征保留时间。
利用这一特性，可以通过与标准寡糖的保留时间比较，对未知样品中寡糖的种类进行鉴定。
2. 寡糖的定量分析hilic色谱柱也可用于寡糖的定量分析。
通过建立标准曲线，确定不同浓度下寡糖的峰面积与浓度的关系，并利用该关系式进行未知样品中寡糖的定量分析。
这种定量方法快速、准确，并且无需复杂的前处理步骤，因此在寡糖分析中具有广泛的应用前景。
3. 寡糖的结构分析hilic色谱柱还可用于寡糖的结构分析。
利用分离效果较好的hilic色谱柱，可以有效地分离具有不同修饰基团或不同链长的寡糖，进而对其结构进行分析。
此外，结合质谱技术，可实现对寡糖的进一步鉴定和结构表征。
三、hilic色谱柱的优势和不足1. 优势hilic色谱柱在寡糖分析中具有一些明显的优势。
HILIC色谱柱的使用注意事项a)HILIC色谱柱的平衡i.使用50倍柱体积的50/50的乙腈/水相缓冲溶液（缓冲液的最终浓度为10mM）平衡新色谱柱ii.在开始进样前，用20倍柱体积的起始流动相平衡色谱柱iii.进行梯度分析时，进样间隔需要用10倍柱体积起始流动相平衡色谱柱说明：色谱柱平衡不充分将导致保留时间漂移b)HILIC流动相需要注意的问题i.流动相中总是至少保持5％的极性溶剂（如5％水相缓冲液，5％甲醇或3％甲醇/2%水相缓冲液等），这保证HILIC硅胶填料始终被水浸润ii.在流动相或梯度中至少保持有机溶剂（如乙腈）的比例不低于40％iii.不要使用磷酸盐缓冲溶液体系，因为磷酸盐缓冲液在HILIC色谱模式下会析出；使用磷酸则没有问题iv.缓冲系统如甲酸铵或乙酸铵水溶液比甲酸或乙酸的水溶液有重现性更好的结果。
如果不能使用缓冲液而一定要使用流动相添加剂如甲酸，最好使用0.2%的浓度而非0.1%v.为得到最好的峰形，在流动相或梯度中总是保持缓冲系统的浓度为10mMc)HILIC进样溶剂需要注意的问题i.如果可能，尽量用100％乙腈溶解样品进样。
避免使用水配制样品溶液，请选择较弱的HILIC溶剂如乙腈、甲醇、异丙醇等配制样品溶液。
ii.最常用的进样溶剂为75/25 乙腈/甲醇，这个体系充分平衡了样品的溶解度和峰形两个因素。
iii.不要用水或DMSO做进样溶剂，它们将导致峰形变得很差iv.使用反相SPE技术将水或DMSO置换成乙腈再进样。
如果不能这样操作，用有机溶剂稀释水或DMSO。
d)其它有关使用HILIC的建议i.开始时可以运行一个95％乙腈至50％乙腈的梯度，如果样品不保留，使用95/3/2乙腈/甲醇/水相缓冲溶液的流动相进行等度分析ii.将流动相中的水换成甲醇、丙酮或异丙醇也可以增加极性化合物的保留iii.请确保弱洗针溶剂/冲洗溶剂包含和流动相一样的高比例有机相，否则峰形会受到影响、再生和保存第四节色谱柱清洗色谱柱清洗、A.清洗和再生压力骤然升高，保留时间或分离度发生波动往往表明色谱柱被污染了。
HILIC色谱柱的使用HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) 色谱柱是一种在许多生物和制药领域应用广泛的分离技术。
与传统的反相色谱柱相比，HILIC 色谱柱采用了相对较极性的固定相材料，利用溶剂中水分子与固定相之间的相互作用，实现化合物的分离。
本文将介绍 HILIC 色谱柱的原理、应用以及使用时的注意事项。
HILIC色谱柱的原理是基于溶剂极性的选择性分离。
传统的反相色谱柱中，通过溶剂与固定相之间的疏水相互作用来分离化合物，而HILIC色谱柱则通过溶剂与固定相之间的亲水相互作用实现分离。
常用的HILIC色谱柱固定相材料有含有羟基的硅胶、含有氨基的硅胶等，这些固定相材料表面具有很强的亲水性，可与溶剂中的水分子形成氢键，从而实现化合物的分离。
HILIC色谱柱具有许多优点。
首先，它能够实现极性化合物的高效分离。
与传统的反相色谱柱相比，HILIC色谱柱更适用于极性化合物的分离，例如亲水性氨基酸、糖类和多肽等。
其次，HILIC色谱柱还可用于极性化合物的富集和纯化。
在样品前处理过程中，可以使用富含有机溶剂和水的混合溶液进行样品的富集，然后再进行柱上分离。
最后，HILIC色谱柱还可用于对极性化合物的结构分析和质谱联用分析。
对于不同极性化合物的混合物，可以首先使用HILIC色谱柱进行分离，然后再利用质谱对分离出的化合物进行鉴定和定量分析。
在使用HILIC色谱柱时，一定要注意以下几点。
首先，选择合适的流动相体系。
由于HILIC色谱柱对水具有较高的亲和力，因此常用的流动相体系包括含有大量水的有机溶剂，如乙腈/水或甲醇/水。
其次，需要合理选择柱温和流速。
在一些情况下，调节柱温和流速可以改善分离效果。
一般来说，较高的柱温和较低的流速可以提高分离效果；而较低的柱温和较高的流速可以加快分析速度。
最后，针对待分离化合物的特性，可能需要对样品进行适当的前处理，如调整样品pH值、添加离子对等。
H I L I C色谱柱介绍
亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。
本文简介了HILIC 的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。
1. HILIC的概念
亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。
它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。
而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。
2. HILIC的分离机制
HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。
更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。
3.HILIC影响保留的主要因素
普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。
影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。
在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。
一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。
如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。
Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid.
4. HILIC与RP-HPLC的比较
传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。
HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示：
Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrile–water containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin.
另外，HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相反，极性较小的物质先出峰，极性较大的物质后出峰。
如图3所示：
Figure 3. Comparison of ESI+MS response using HILIC and RP conditions. SIR channels of acetylcholine (m/z 146.2) and choline (m/z 103.9); Columns: 100 mm×2.1 m m, 1.7μm (A) ACQUITY UPLC BEH C18 (B) ACQUITY UPLC BEH HILIC. Peaks: 1 = acetylcholine, 2 = choline
5.HILIC与质谱技术联用
HILIC可为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留。
通过优化多个色谱参数，有利于实现目标组分和基质中干扰物质的分离，从而降低基质效应的影响；而含有高比例水溶性有机相的流动相又有利于提高质谱离子化效率，进而提高质谱分析的灵敏度。
质谱响应在某种程度上是取决于流动相中有机相的比例。
采用ESI源时，毛细管中离子化的过程类似于一个电泳过程。
由于毛细管被加高压，形成带电液
滴。
溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，当液滴表面电荷产生的库仑排斥力与液滴表面的张力大致相等时，液滴会分裂成更小的液滴，对于半径<10nm的液滴, 液滴表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用最终导致部分离子从液滴表面蒸发出来，形成了气相离子。
而有机相的表面张力比水相的表面张力小得多。
因此，在相同的条件下，流动相中有机相的比例越高，质谱的响应越高。
从图4可以看出，在HILIC柱上的响应比在RPLC柱上的响应高出十倍左右。
Figure 4. Chromatograms comparing the retention and MS response of analyte on C18 m Inertsil ODS-3; mobileμcolumn and HILIC column. (A) Column: 2.1×50mm, 3 phase: methanol-water containing 0.2% formic acid (15:85, v/v) (B) Column: m ACQUITY UPLC BEH HILIC; mobile phase: methanol-water containingμ2.1×50mm, 1.7 0.2% formic acid (85:15, v/v)
6. HILIC柱的使用
（1）初次使用HILIC柱时，应采用50倍柱体积的乙腈-水（50:50）平衡，在进第一针前，应用初始流动相平衡20倍的柱体积。
（2）HILIC柱冲柱子时，采用的是乙腈-水（50:50）来洗去极性物质。
如果解决不了问题，可以使用乙腈-水 (5:95) 来冲柱子。
长时间不用时，将柱子保存在乙腈-水(95:5)中。
（3）要保证流动相中至少40%的有机相。
流动相中使用添加剂时，醋酸铵、甲酸铵的重现性优于乙酸和甲酸。
如必须使用甲酸等，0.2%优于0.1%，不要使用磷酸。
（4）水是最强的洗脱溶剂，所以强洗和弱洗溶剂与反相系统的正好相反：弱洗是初始流动相，即高比例的有机相。
并且进样溶剂最好是100%的有机相。
1.HILIC柱如何平衡？
HILIC柱使用70%的乙腈水溶液平衡。
2.HILIC柱如何保存？
HILIC柱使用 90%的乙腈水溶液保存。
1. 一直使用Waters 的HILIC较多，感觉质量还行，但是要小心waters 的HILIC是分两种类型的填料的 BEH HILIC和 HILIC。
很多waters 的销售都不清楚之一点。
但是大家一定要注意，这两款的区别是很大的，保留的效果是不同的。
2. 费罗门公司的HILIC柱，感觉是小家碧玉型的，保留能力不是太强，但是清秀文雅，峰型很好看。
3. HILIC的流动相推荐使用乙腈。
4. 推荐使用乙酸铵，这也以后再说。
5.不能使用100% 的乙腈，推荐使用到95%就行了。
不能使用60%以下的乙腈。
所以梯度范围小。
但是足够用了。
因为100%的乙腈可能对HILIC的中亲水的部分不利于键合相的伸展开。
使得保留性能下降。
其中的解释也是经验，研究论文解释的也让人不太信服。
所以大家可以一起讨论一下这点。
使用甲醇的问题也是这样的。
在甲醇分子附近，HILIC的保留能力下降了，色谱峰型较差。
这也是经验结果。
Pubmed compound XlogP -2 -3，。
