第四章 酶蛋白的化学修饰
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酶工程电子教案第四章酶分子修饰教学目标:◆通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
◆通过酶分子修饰,可以使酶分子结构发生某些改变,就有可能提高酶的活力,增强酶的稳定性,降低或消除酶的抗原性等。
◆通过酶分子修饰,研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响,可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。
◆酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰, 大分子结合修饰,侧链基团修饰,肽链有限水解修饰,核苷酸链有限水解修饰,氨基酸置换修饰,核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰等。
教学重点和难点大分子结合修饰的原理和方法;酶分子的定向进化。
教学方法教师讲授为主,结合一次上机实验,加深学生对酶分子结构与功能关系的认识,以及对酶分子修饰方法的掌握。
核酶的内容自学。
1、金属离子置换修饰◆把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。
◆有些酶分子中含有金属离子,而且往往是酶活性中心的组成部分,对酶催化功能的发挥有重要作用。
α-淀粉酶中的钙离子(Ca2+)谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)酰基氨基酸酶分子中的锌离子(Zn2+)超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)等。
◆若从酶分子中除去其所含的金属离子,酶往往会丧失其催化活性。
◆若用另一种金属离子进行置换,则可使酶呈现出不同的特性。
1.1金属离子置换修饰的方法:◆金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。
◆金属离子置换修饰的过程主要包括如下步骤:(1)酶的分离纯化:首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化,除去杂质,获得具有一定纯度的酶液。
(2)除去原有的金属离子:在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂,如乙二胺四乙酸(EDTA)等,使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。
(3) 加入置换离子:于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子,酶蛋白与新加入的金属离子结合,除去多余的置换离子,就可以得到经过金属离子置换后的酶。
生物化学 第四章 酶1、什么是酶?(酶的定义是什么)?酶的化学本质是什么?(1)酶是由活细胞产生的对特异底物具有高效催化作用的蛋白质和核酸(2) 化学本质:蛋白质2、什么是单体酶?寡聚酶?多酶复合体?多功能酶?单体酶:由一条多肽链构成的酶,溶菌酶;寡聚酶:由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶,磷酸化酶a ;多聚复合体:由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。
可一次催化连锁反应的复合体,丙酮酸脱氢酶系;多功能酶:一条多肽链上同时具有多种不同催化活性的酶,生物进化中基因融合的产物,DNA 聚合酶3、简述酶的分类?单纯酶、结合酶的定义是什么?酶蛋白、辅助因子的作用? 酶的分类:单体酶、寡聚酶、多酶复合体及多功能酶单纯酶:仅由多肽链组成,如淀粉、脲酶、核糖核酸酶等结合酶:由蛋白质部分和非蛋白质部分组成,其催化作用依赖于两部分的共同参与,如氨基转移酶、碳酸酐酶、乳酸脱氢酶等。
酶蛋白的作用:决定反应专一性辅助因子的作用:决定反应的种类与性质4、辅助因子的分类及分类依据是什么?各自(辅酶、辅基)的作用分别由哪些? 辅助因子的分类:辅酶和辅基。
分类依据:按照其与酶蛋白结合的紧密程度及作用特点不同辅酶的作用:与酶蛋白共价键结合紧密,不可用透析、超滤方法除去 辅基的作用:与酶蛋白非共价键结合不牢固,可用透析、超滤方法除去5、什么是酶的活性中心?酶的活性中心包括哪些基团?这些基团的功能是什么? 酶的活性中心:酶分子中必需基团相对集中,形成一个与底物特异性结合并催化其反应生成产物的具有特定三维结构的区域。
活性中心的基团 (1)结合基团:可与底物结合(2)催化基团:催化底物发生化学反应6、什么是酶原?什么是酶原激活?酶原激活的机制是什么?简述酶原激活的生理意义?酶原:是细胞内合成或初分泌时处于无活性状态的酶的前体 酶原激活:在一定条件下,酶原向有活性酶转化的过程。
酶原激活的生理意义:(1)酶原是酶的安全转运形式,避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化,并使酶在特定的部位和环境中发挥作用,保证体内代谢正常进行。
第四章酶分子修饰与应用1 酶分子修饰(Modification of Enzyme Molecule):通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的过程。
2 酶分子修饰的意义?(1)提高酶的活力;(2)增强酶的稳定性;(3)降低或消除酶的抗原性;(4)研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响,进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系。
第一节酶分子的主链修饰1 酶分子的主链修饰:利用酶分子主链(肽链或核苷酸链)的切断和连接,使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变,从而改变酶的特性和功能的方法。
2 酶分子主链修饰的意义?(1)可提高酶的活力;(2)可降低或消除酶的抗原性;(3)可预测酶活性中心在主链上的位置,从而了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献。
(一)主链的切断修饰①主链断裂后,引起酶活性中心的破坏,酶的催化功能丧失(用于探测酶活性中心的位置)。
②主链断裂后,酶活性中心的空间构象维持不变,酶的催化功能也可以保持不变或损失不多,但是抗原性有发生改变。
这样可以提高药用酶的使用价值。
③主链断裂有利于酶活性中心的形成,则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。
(二)主链的连接修饰将两种或者两种以上的酶通过主链连接在一起,形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法称为酶的主链连接修饰。
在一个酶分子上具有两种或多种催化活性的酶称为多酶融合体。
通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因,再经过克隆和表达,有可能获得各种多酶融合体。
第二节酶的侧链基团修饰采用一定的方法使酶的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
酶的侧链基团的意义:(1)可以研究各种基团在酶分子中的作用,并可以用于研究酶的活性中心中的必需基团。
如果某基团修饰后不引起酶活力的显著变化,则可以认为此基团属于非必需基团;如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失,则此基团很可能是酶催化的必需基团。
名词解释:每章的关键词(英文),就是表达本章中心内容的有实质意义的词汇。
各章重点第一章绪论一、酶工程的概念、分类及其研究内容。
生物酶工程的内容、什么是核酶二、简述酶活力测定方法的原理;酶活力单位;比活力等第二章酶的生物合成与发酵生产一、克隆酶:利用DNA重组技术而大量生产的酶。
二、什么是抗体酶?抗体酶:抗体酶是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。
三、酶生物合成的模式四、一些概念的区别:操纵子与操纵基因、诱导酶与组成酶、胞内酶与胞外酶、产酶动力学五、原核酶合成调节的类型有哪些?六、在酶制剂工业生产中为什么以微生物发酵生产为主?七、如何提高酶的产量?1选育优良的产酶细胞株系(生产组成型酶突变株的筛选,抗分解代谢阻遏突变株的选育,抗反馈阻抑突变株的筛选)2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂第三章酶的提取与分离纯化一、细胞破碎的目的、方法及原理。
二、酶抽提的目的及方法。
三、常用沉淀法的种类及原理。
四、常用沉淀法的种类及原理。
盐析法分离蛋白质的原理。
五、简述酶分离纯化方法及工艺程序的选择策略。
先选用非特异的、低分辨的技术,去除主要的杂质并使酶溶液浓缩;如沉淀、超滤和吸附等。
随后采用高效分离的手段;如离子交换层析、亲和层析。
将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。
如凝胶过滤层析。
六、简述影响酶提取的主要因素及影响规律。
抽提溶质的性质(酸性酶宜用碱性溶剂抽提,碱性酶宜用酸性溶液抽提,极性大的酶宜用极性溶剂抽提,含有较多非极性基团的酶宜用有机溶剂抽提。
)。
抽提溶剂的用量(增加用量可以提高酶的提取率。
但是过量的抽提溶剂,会使酶的浓度降低,对酶的进一步分离纯化不利。
用量一般为原料体积的3~5倍,最好分次抽提)温度(提取时温度对酶的提前效果有明显影响。
一般来说,适当提高温度,可以提高酶的溶解度,增大酶分子的扩散速度。
但温度过高易引起酶变性失活,所以提取温度不宜过高。
要根据被抽提酶的酶学性质选择适宜温度)pH 对酶的溶解度和稳定性有显著影响。
酶的化学修饰方法通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目的。
这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。
PEG化修饰聚乙二醇或甲基聚乙二醇有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000 ~ 10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。
1977 年 Abuchowski等[1]率先用 PEG修饰牛血蛋白BSA, 发现 PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期大大延长, 且无免疫原性。
其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰。
PEG必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。
活化的方法如图1所示.图1聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性, 无毒, 水溶性较高的亲水聚合物,其重复单元为氧乙烯基, 端基为两个羟基, 呈线性或支化链状结构[2]. PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物[3]。
姚文兵等[4] 用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了修饰研究, 反应方程式如Eq. 1所示.Goodson等[5]通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如Eq. 2所示.[1]Abuchowski A, Van Es T, Palczuk C N, e t al . Ef f e ct of covalent at tach mentof polyethylene glycol on immun ogenicity and circulating life of bovine liver catalase [ J ] . J . Biol .Chem. , 1977 , 252: 3578- 3581.[2]Bailon, P.; Berthold, W.Pharm. Sci.Technol. Today 1998, 1, 352.[3]Hooftman, G.; Herman, S.; Schacht, E. J. Bioact. Compat. Polym. 1996, 11, 135.[4]Yao, W. B.; Lin, B. R.; Shen, Z. L.; Wu, W. T. Chin. J. Biochem. Pharm. 2001, 22, 289 (in Chinese).(姚文兵, 林碧蓉, 沈子龙, 吴梧桐, 中国生化药物杂志, 2001, 22, 289.)[5]Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/technology 1990, 8, 343.。