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实验四细菌的芽孢染色细菌的芽孢是指在环境恶劣时，细菌会形成内部有严密壳层保护的休眠结构。
芽孢可以存活在高温、低温、干旱和化学物质等极端环境中，具有极强的耐受性。
因此，了解细菌的芽孢形态和染色技术对于临床医学和微生物学研究具有重要意义。
一、理论知识芽孢染色是一种特殊的细菌染色方法，该方法是通过将细菌在特定的温度和时间条件下培养，诱导细菌形成芽孢。
然后用特殊染剂染色，可以使芽孢呈现出特定的颜色。
这种染色方法可以将细菌分为两类：芽孢形成阳性细菌和芽孢形成阴性细菌。
在芽孢染色实验中，需要用到以下染剂：1. 碘液：可以使细菌和芽孢的细胞质和内浆颜色变成深蓝色。
2. 芽孢绿：能够将芽孢染成绿色。
二、实验步骤1. 准备玻璃片。
取两块无菌的玻璃片，用酒精灼烧消毒，并晾干备用。
2. 细菌培养。
取一株待检测的细菌，接到含有适当营养成分的琼脂平板上。
在适当的温度下，通常是30-37℃，使细菌生长至需要形成芽孢的生长阶段。
3. 热处理。
将培养好的细菌涂在一块玻璃片上，然后将其放置在巴氏杀菌器中，用高温（通常是80℃）处理大约5分钟。
这里的处理过程可以模拟极端环境，诱导细菌形成芽孢。
4. 染色涂片。
将热处理后的细菌涂片放置在滴定瓶中，加入碘液，在室温下静置几分钟。
不要让碘液干燥，否则会影响后续染色效果。
之后，用酒精洗去多余的碘液。
5. 脱色处理。
将染色过的细菌涂片放入酸酒精溶液中，脱色1-2秒钟。
这一步会去除多余的染料，使芽孢显现出绿色。
6. 水洗和固定。
用自来水清洗脱色后的涂片，然后用火焰进行烘干和固定。
三、实验结果与分析芽孢染色的阴性和阳性结构特点如下：芽孢阳性：芽孢位置不定，涂片颜色为绿色。
四、注意事项1. 操作前请认真研究操作步骤并准备好所有必需的实验器材。
2. 涂片需要在室温下进行，但不宜长时间暴露于室外，以免可能的污染干扰实验结果。
3. 涂片需要在染色后及时清洗和固定，否则会有失真或污染的风险。
4. 在过程中要注意无菌操作，以避免其他微生物污染涂片。
芽孢的定义有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。
1个细菌细胞只形成1个芽孢，有的在细胞一端，有的在细胞中部。
由于芽孢是在细胞内形成的，所以也常称之为内生孢子，亦称芽孢。
每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。
芽孢的形态在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。
芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。
在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌，梭状芽孢杆菌的芽孢位于菌体中间。
破伤风杆菌的芽孢位于菌体的一端，使菌体呈鼓槌状。
好氧芽孢杆菌属(Bacillus)和厌氧的梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的所有细菌都具有芽孢。
在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢，球菌中只有芽孢八叠菌（Sporosarcina）属产芽孢。
弧菌中只有芽孢弧菌属(Sporovibrio)产芽孢.芽孢形成和结构芽孢的形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面的变化。
光学显微镜和电子显微镜观察研究的结果，表明芽孢的形成在结构上主要经历以下几个阶段：①核物质融合成轴丝状（杆状）。
②在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。
③小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。
前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体。
在光学显微镜下观察未染色的活细菌，可以看到前孢子是一个清亮的、与菌体其他部分明显不同的区域。
④前孢子再被多层膜包围，如皮层、孢子衣等，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁的溃溶而释放出来。
芽泡形成过程中在化学成分方面也发生很大变化。
生芽孢的细胞大量吸收钙离子并大量合成营养细胞中没有的吡啶二羧酸。
在成熟的芽孢中，芽孢原生质体含有极高的吡啶二羧酸钙，在新合成的、具有特殊化学构造的外层（皮层和孢子衣，有时还有芽孢外壁）中也有这种物质。
芽孢染色法的原理芽孢是一种细菌的休眠状态，对于各种环境条件能够表现出强大的抗性。
这使得芽孢能够在各种恶劣的环境条件下存活，并在合适的时机再次发芽。
芽孢的形成过程主要分为四个阶段：芽孢的形成、夏眠阶段、萌芽和生长阶段。
这些阶段与芽孢的抗性、特性以及形态变化密切相关。
芽孢染色法的原理主要基于芽孢的特殊结构和形态。
芽孢由外壳、蛋白质鞘、皮层和核闪进行保护。
其中，外壳主要由质蛋白组成，能够抵抗酸、碱和消毒剂等环境应激。
外壳的结构使得芽孢具有耐高温、耐干燥和耐化学物质的特性。
蛋白质鞘是一层覆盖外壳的蛋白质薄膜，起到保护芽孢不受外界环境刺激的作用。
皮层是芽孢的内层，主要由特殊的多聚糖、脂质和硬蛋白组成。
它能够吸附外界营养物质，并在萌芽时提供所需的能量。
核闪是芽孢中存储的DNA和酶等生物大分子，具有很高的稳定性和抵抗能力。
芽孢染色法的操作步骤是：将待检菌株接种到固体培养基上进行培养，促使细菌进入芽孢形成阶段。
然后，将培养的细菌制备染色液，如马来酸钾染色液或热石蜡染色液。
将菌涂片浸入染色液中，保持一定的时间。
之后，将菌涂片洗净，并使用染色剂进行染色，以提高芽孢结构的可见性。
芽孢染色主要通过芽孢的特殊结构和形态特点来进行鉴定。
经过染色后，芽孢的形态特征和染色结果可以反映出芽孢的各种特性，如大小、颜色、位置以及抗性等。
通常，若芽孢为青绿色或者绿色，说明其表面的毛细管在空气中被氧化，表示芽孢为成熟状态。
反之，如果芽孢为无色或白色，则表示其仍处于萌芽状态或未成熟状态。
芽孢染色法的优点是简单易行，不需要复杂的处理步骤和仪器设备。
它能够快速地进行细菌芽孢的鉴定，并且不会对细菌的形态、结构和活性产生影响。
因此，芽孢染色法被广泛应用于微生物学实验室中，用于鉴定和检测环境样品以及食品样品中的芽孢形成菌。
芽孢的名词解释
芽孢（endospore）又称内生孢子，是细菌休眠体。
常见的产芽孢细菌主要为芽孢杆菌属（Bacillus）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、芽孢乳酸菌属（Sporolaetobacilbs）等。
产芽孢细菌在营养条件缺乏时，在菌体内形成圆形或椭圆形的芽孢休眠体。
芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等，在灭菌监测中，可利用芽孢的高抗逆性制备生物指示剂。
尽管芽孢与孢子的英文名称均为spore，但二者的界限从来就没有混淆过，微生物学界也不曾有过分歧意见。
恶劣环境下，一个细菌产生一个芽孢，条件适宜时重新成为一个细菌，数量没有增加，因此芽孢不是细菌的繁殖体，是休眠体，因此称作“芽胞”更为确切。
《微生物学名词（第2版）（2012）》是全国科学技术名词审定委员会审定公布的第二版微生物学名词，其中收录“芽孢”为规范词条，又称“芽胞”。
芽孢菌（spore-forming bacteria）是一类具有芽孢形成能力的细菌，包括属于芽孢杆菌属（Bacillus）和芽孢丝菌属（Clostridium）的细菌。
这些细菌能够在不适宜的环境条件下形成芽孢，以在恶劣条件下存活和传播。
以下是芽孢菌的一些生理生化特征和机制：
芽孢形成：
芽孢菌在适应不利环境时，通过芽孢形成进入休眠状态以保护其遗传物质和细胞结构。
芽孢形成是通过细胞分裂产生小孢子，随后在细胞内形成厚壁和外层膜的过程。
耐热性：
芽孢菌芽孢具有较高的耐热性，可以在高温条件下存活。
芽孢的耐热性主要是由于其外层膜的结构和成分，能够防止高温下的蛋白质和核酸降解。
营养代谢：
芽孢菌具有多样化的营养代谢能力，可以利用不同类型的有机物和无机物作为能源和碳源。
芽孢菌在有限营养条件下能够产生胞外酶和毒素等生物活性物质。
耐酸性：
芽孢菌的芽孢可以耐受低pH条件，如胃酸，以在消化道中存活和传播。
芽孢菌的酸耐受性与其细胞壁结构、膜脂组成和调节机制有关。
芽孢萌发：
芽孢菌的芽孢在适宜条件下可以发芽，并重新进入生长状态。
芽孢萌发受到多种因素的影响，包括温度、营养物质、氧气和水分等。
芽孢菌的生理生化特征和机制使其具有较强的生存能力和适应性，能够在广泛的环境中存在和繁殖。
对于食品工业和环境卫生等领域，了解芽孢菌的生理生化特征对于控制其生长和传播具有重要意义。
细菌的芽孢
概念：某些细菌生长到一定阶段或在一定环境条件下，细胞的正常生长和分裂停止，细胞内细胞质浓缩，逐步行成一个圆形、椭圆形或圆柱形的，对不良环境有较强抵抗力的特殊结构，称为芽胞。
芽胞成熟后可自行从芽胞囊中释放出来。
因芽胞的形成都是在细胞内，故又称内生孢子。
﹙十﹚芽胞(endospore，spore)
芽胞
芽胞囊
◆电镜下芽胞图及概念
(3) 芽孢（endospore，spore）
某些细菌在生长发育后期，细胞内形成一个圆形或椭圆形的抗逆休眠体，称为芽孢。
（看书P34表及芽孢类型图，幻灯片060）
芽孢的特点
抗逆性：抗热、抗辐射、抗化学药物、抗静水压的能力。
表——一些芽孢菌的抗热性（引自食品微生物学）——打印
休眠能力：休眠期间不能检查出任何代谢活力，又称为隐生态。
在普通条件下芽孢可保存几年~几十年生活力，在一些考古活动中分离出的芽孢甚至已保存了数百年到上千年。
产孢种类：杆菌中只有Bacillus（芽孢杆菌属）和Clostridium（梭状芽孢杆菌属）能产生芽孢，球菌中Sporosacina（芽孢八叠球菌属）能产生芽孢。
弧菌和螺菌属中有一些种能形成芽孢。
（幻灯片059）
芽孢的构造：（幻灯片065.061.062.063.064）
芽孢囊（sporangium），母细胞的空壳；
孢外壁（exsosporium），母细胞残留物，主要由脂蛋白组成，含少量氨基糖，透性差；
芽孢衣（spore coat），约3nm，层次多（3~15层），主要由疏水性角蛋白和少量磷脂蛋白组成，芽孢衣对溶菌酶、蛋白酶、表面活性剂有很强的抗性，对多价阳离子渗透性很差；
皮层（cortex），占芽孢体积的36~60%，含有大量芽孢皮层特有的芽孢肽聚糖，特点是呈纤维束状、交联度小、负电荷强、可被溶菌酶水解，皮层中还含有占芽孢干重7~10%的DPA-Ca （吡啶二羧酸钙盐），不含磷壁酸。
皮层的渗透压可高达20个大气压左右，含水量约70%，略低于营养细胞（约80%），而比芽孢的平均含水量（约40%）高出许多；
核心（core ，包括芽孢壁、芽孢膜、芽孢质、核区）等结构，又称芽孢原生质体，含水量极低，与一般细胞的区别仅为芽孢壁中不含磷壁酸，芽孢质中含有DPA-Ca。
看书P35图2-19—芽孢肽聚糖和DPA
在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。
产生芽孢的几个属：
(Bacillus)芽孢杆菌属
(Clostridium)梭状芽孢杆菌属
(Sporosarcina)芽孢八叠球菌属
2、能形成芽孢的细菌种类
产孢种类：杆菌中只有Bacillus（芽孢杆菌属）和Clostridium（梭状芽孢杆菌属）能产生芽孢，球菌中Sporosarcina（芽孢八叠球菌属）(只有一个种）能产生芽孢。
弧菌和螺菌属中有一些种能形成芽孢。
（幻灯片059）
芽孢的结构
芽孢的外壁层厚而致密，主要成分为脂蛋白，通透性差,不易着色。
核心含有大量的DNA、RNA、蛋白质酶等物质，还含有2,6—吡啶二羧酸（DPA）,DPA是芽孢特有的成分。
一般以DPA—Ca的形式存在。
皮层主要含芽孢肽聚糖、DPA—Ca，皮层体积大，比较致密。
芽孢平均含水量低,约40%.
3、芽孢的组成和结构
芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心：
芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心
4、芽孢的形成过程
芽孢的形成
产芽孢细菌在环境营养缺乏及有害代谢产物积累时，或者有些菌种在其达到一定生理阶段时，就开始形成芽孢。
从形态变化上看，芽孢的形成可以分为七个阶段：（幻灯片066）
a) 轴丝形成；
b) 不对等分裂，开始形成前孢子；
c) 形成双层隔壁，抗辐射性提高；
d) 开始形成皮层，折光率增高；
e) 芽孢衣合成结束；
f) 皮层合成完成，芽孢成熟，抗热性出现；
g) 芽孢囊裂解，芽孢游离。
在化学成分方面：大量吸收钙离子，合成吡啶二羧酸。
★1、对高温、干燥、辐射、化学药物有强大的抵抗力。
★2、含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色，折光性强。
★3、芽胞内新陈代谢几乎停止，处于休眠状态，但保持潜在萌发力。
★4、一个芽孢萌发只产生一个营养状态的细胞。
5、芽孢的特性
（1）多层膜结构，通透性很差。
（2）组分：水分少（5%），DPA（吡啶二
羧酸），富含疏水性角蛋白。
（3）抗性强：热、酶解、辐射、药物。
（4）休眠体，新陈代谢几乎停止，一个芽
孢产生一个个体。
Table. Differences between endospores and vegetative cells
6、芽孢抗热机制
目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。
过去还曾认为芽孢抗热与DPA有关，现在已否认了这种假设。
芽孢抗热机制
关于芽孢抗热的本质至今尚无圆满的解释，一种较新的理论叫做“渗透调节皮层膨胀学说”（osmoregulatory expended cortex theory），综合了较新的实验结果，有一定的代表性。
该学说认为芽孢的抗热性在于：
芽孢衣对多价阳离子和水分的透性差及皮层的离子强度高，从而使皮层有极高的渗透压去夺取核心部分的水分，结果造成皮层部分的充分膨胀，而核心部分的生命物质却形成高度失水状态，因而产生极强的耐热性。
其它解释：Ca与DPA的螯合作用会使芽孢中的生物大分子形成一种稳定的耐热性凝胶。
总之，芽孢的耐热性机制还有待于深入研究。
研究意义：
a) 芽孢是细菌鉴定中的一项重要的形态学指标；
b) 芽孢的存在有利于这类菌种的筛选和保藏；
c) 能否杀灭一些代表菌种的芽孢是衡量各种消毒灭菌措施的主要指标。
7、伴胞晶体（parasporal crystal）
少数芽孢杆菌，如Bacillus thuringiensis（苏云金芽孢杆菌）在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一个菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（即δ内毒素）称为伴胞晶体。
它的干重可达芽孢囊的约30%，由18种氨基酸组成，大小约0.6＊2.0μm。
伴胞晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目昆虫的幼虫有毒杀作用，因此可以用做生物农药。
伴胞晶体（parasporal crystal）
（幻灯片069）少数芽孢杆菌，如Bacillus thuringiensis（苏云金芽孢杆菌）在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一个菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（即δ内毒素）称为伴胞晶体。
它的干重可达芽孢囊的约30%，由18种氨基酸组成，大小约0.6＊2.0μm。
伴胞晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目昆虫的幼虫有毒杀作用，因此可以用做生物农药。
细菌的其它休眠构造：固氮菌的胞囊（cyst）、粘球菌的粘液孢子（myxospore）、蛭弧菌的蛭胞囊（bdellocyst）、以及嗜甲基细菌和红微菌的外生孢子等。
9、芽孢的本质
即不是细菌生活周期的必经阶段，也不是细菌繁殖的一种形式，又不是对环境的消极反应，而是一种生命形式，一种独立的休眠体。
芽孢与营养细胞的比较（幻灯片068）
8、研究芽孢的意义：
1、分类鉴定
2、保存菌种
3、分离菌种
4、生物杀虫
5、灭菌标准
a) 芽孢是细菌鉴定中的一项重要的形态学指标；
b) 芽孢的存在有利于这类菌种的筛选和保藏；
c) 能否杀灭一些代表菌种的芽孢是衡量各种消毒灭菌措施的主要指标。
（1）鉴定价值：不同菌类芽孢的
大小、位置、形状不同。
（2）作为无菌标准。
