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高效液相色谱测定婴儿配方食品中低聚半乳糖方法的研究
[摘要]本实验对高效液相色谱测定婴儿配方食品中低聚半乳糖的方法进行研究，使用β半乳糖甘酶对低聚半乳糖进行酶解，通过HPLC测量酶解前后乳糖及半乳糖的质量差来计算样品中低聚半乳糖的总含量。
【关键词】高效液相色谱；β半乳糖甘酶；低聚半乳糖
1、引言
低聚半乳糖是一类可溶性食用纤维素，是1-7个半乳糖残基与葡萄糖或乳糖的还原端相连的低聚糖。
低聚半乳糖的α糖甘键中含有β折叠，小肠中的β半乳糖甘酶可以消化α糖甘键，但是β半乳糖甘酶经常缺失或其活性受到抑制。
2、实验方法
2.1 样品的前处理
2.4 数据处理
3、结果分析
3.1 萃取时磷酸缓冲溶液用量对低聚半乳糖加标回收率的影响
本实验通过对加标回收率的测量，对前处理方法中低聚半乳糖萃取时磷酸缓冲溶液用量进行了优化。
前处理其他条件设为：加酶量1.0ml，酶解温度为60℃，酶解时间为30min。
由表3-1可以看出，磷酸缓冲溶液用量小于40ml时，低聚半乳糖加标回收率随着磷酸缓冲溶液用量的增加而显著增加，其中磷酸缓冲溶液使用量为40ml时低聚半乳糖的加标回收率最高。
4、结论
本实验使用单因素分析法对HPLC检测婴儿配方食品中低聚半乳糖的方法进行研究，使用β半乳糖甘酶对低聚半乳糖进行酶解，通过使用HPLC测量酶解前后乳糖及半乳糖的质量差来计算样品中低聚半乳糖的总含量。
本实验对前处理中的磷酸缓冲溶液用量，加酶量，酶解时间和酶解温度进行优化，其最佳前处理条件为：萃取时磷酸缓冲溶液用量为40ml，加酶量为1.0ml，酶解时间为30min，酶解温度为60℃，其加标回收率达到82.40%。
图1 分离效果图
样品前处理
将苹果样品洗净、擦干、切碎并混匀，称取5.00 g 于研钵中，加入6 mL的蒸馏水磨制均匀。
磨制均匀后全部移入离心管中，4000 r·min-1离心6 min。
分离出离心液之后，将离心液导入干净的试管中，再向盛有沉淀的离心管中加入12 mL蒸馏水并搅拌，然后再进，最后将所有的离心液放入150 mL容量瓶中，并加蒸馏水稀释至相应刻度。
稀释液再用微孔滤膜过准备HPLC分析用。
色谱分析
对过滤后的稀释液进行HPLC分析。
结果与分析
色谱的保留时间
1.3的色谱条件下，分别对5种糖溶液、苹果样品和酸奶样品进行测定，发现果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及乳糖的保留时间分别是7.1、8.0
13.6 min及15.7 min，分离效果良好，样品图中也未见干扰部分。
2.2 标准曲线和最低检出限
精密配制5种糖组分的混合标准溶液，按照上述操作条件分离检测，用质量浓度（X，单位为
作为横坐标，色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，最后得5种糖组分标准曲线的回归方程
系数及最低检测限见表1。
2.3 精密度实验
配制5种糖组分的混合标准液4份，并依次进样计算变异系数，结果见表2，RSD在4.5%～
均小于10%。
实验表明，5种糖组分的回收率均大于90 RSD均小于10%，说明本测定方法有较好的准确性和重复性。
现代食品XIANDAISHIPIN
食之不完的美筵。
——爱默生。
高效液相色谱-示差折光法测定饲料中大豆低聚糖含量潘城;欧阳立群;林钦;黄永辉;刘芳;梁敏【摘要】A method for the determination of soybean oligosaccharides in feeds by high performance liquid chro-matography method of refractive index(HPLC-RID)was developed.The samples were extracted with50%ethanol.The sep-aration was carried out with a mobile phase of water-acetonitrile.The analytes were detected by refractive index detector. The results showed that,there was a good linear correlation(R=0.9999~1.0000)between the peak area and concentration of sucrose,raffinose and stachyose within 0.5 ~ 10 mg/mL.The qualitative detection limit (LODs)of sucrose,raffinose and stachyose were less than 0.020%,and the quantitative detection limit (LOQs)were 0.036%,0.053% and 0.066%,respec-tively.The average recoveries for samples of soybean oligosaccharide were 90.6% ~106%,and the relative standard devia-tions (RSDs)were in the range of 1.6% ~ 3.5%.The results obtained by experimental verification showed the method was simple,rapid and reliable for the determination of soybean oligosaccharides in feeds.%本实验建立了饲料中大豆低聚糖的高效液相色谱分离检测方法。
高效液相色谱法测定食品中功能性低聚异麦芽糖高效液相色谱法测定食品中功能性低聚异麦芽糖（续）三、结果与分析3.1标准曲线的制作按照表1所示对标准混合液进行色谱测定。
表1 标准混合液浓度表（略）标准曲线的线性：根据实验数据求得麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、潘糖、异麦芽三糖、麦芽四糖、异麦芽四糖、麦芽五糖的线性回归方程依次为：y = 0.00000550 x + 0.09949685（R2=0.9912）；y = 0.00000769 x - 0.02658243（R2=0.9751）；y = 0.00000552 x + 0.00145331（R2=0.9877）；y = 0.00000643 x - 0.00042279（R2=0.9989）；y = 0.00001441 x - 0.00411445（R2=0.9998）；y = 0.00000630 x - 0.00224903（R2=0.9997）；y = 0.00001437 x - 0.00582476（R2=0.9996）；y = 0.00001451 x - 0.03036338（R2=0.9979）。
3.2样品的测定样品经溶解、除蛋白、定容、过滤进样，利用标准回归方程求得样品中各组分的含量，表2列出所测样品中各糖含量（%）。
表2 样品中各糖的含量（%）（略）四、讨论4.1样品前处理方法的选择4.1.1除蛋白试剂的选择样品中含有大量蛋白对糖测定时色谱出峰产生影响，本方法共采用了两种除蛋白试剂，结果显示：21.9%乙酸锌和10.6%亚铁氰化钾各加5mL去除蛋白样品测定时在固定时间出现同样的峰，而用50%三氯乙酸去除蛋白不会出现这一问题。
故，本方法采用50%三氯乙酸去除蛋白。
4.1.2样品超声时间的选择超声时间对样品中糖的溶出程度影响不大。
故，本方法对样品进行20min超声振荡处理。
4.2色谱柱的选择本方法先后采用了两类不同原理的色谱柱，分别为氨基（键合相）色谱柱和阳离子交换色谱柱（专用糖柱）。
低聚木糖的测定（高效液相色谱测定方法）五．低聚木糖的测定(高效液相色谱测定方法)本方法适合食品中低聚木糖的含量的测定本方法检测限：食品中低聚木糖为0.10%。
（一）方法提要试样中的低聚木糖经提取后在氨基色谱柱上分离，根据保留时间定性，用蒸发光散射检测器测定低聚木糖的含量。
（二）仪器1. 高效液相色谱仪带SEDEX 75蒸发光散射检测器。
2. 超声清洗仪。
3. 天平（精确到0.001g和0.0001g）。
4. 微孔滤膜（PVDF 0.45 μm）。
（三）试剂1. 色谱用水（Millipore纯水器制备）。
2. 乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL乙酸,加水溶解至100mL。
3. 亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解至100mL。
4.木二糖对照品，Wako公司(纯度≥90%)。
5. 木二糖标准溶液（10.0mg/mL）：精确称取50mg木二糖用蒸馏水定容至5mL 容量瓶中，即得木二糖标准溶液。
（四）测定步骤1. 样品处理：①固体样品：取均匀样品1.0g(精确到0.1mg)于150ml锥形瓶中，加水30ml，超声20min，再加入乙酸锌溶液，亚铁氰化钾溶液各2ml，摇匀后，经滤纸过滤到50ml 容量瓶中，用水定容到刻度。
取此滤液通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
②液体样品：取均匀试样10mL(精确到0.1mL)置于150ml锥形瓶中，加水20ml，超声20min，再加入乙酸锌溶液，亚铁氰化钾溶液各2ml，摇匀后，经滤纸过滤到50ml容量瓶中，用水定容到刻度。
取此滤液通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
2. 标准工作曲线制作。
精密吸取木二糖标准溶液1.0 ml，5.0 ml，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，摇匀。
分别取10μL标准工作系列溶液进样分析，以测得的木二糖的峰面积，分别对木二糖的浓度绘制标准曲线。
3．色谱条件①色谱柱：Cosmosil Sugar D 氨基液相色谱柱250 mmi.d.×4.60mm, 5μm ；②流动相：色谱用水＋乙腈=22+78(V+V)；③流速：1.0mL/min ；④柱温：35℃；⑤蒸发光散射检测器：蒸发温度35℃，压力 3.5Bar ；4. 样品测定。
五．低聚木糖的测定(高效液相色谱测定方法)本方法适合食品中低聚木糖的含量的测定本方法检测限：食品中低聚木糖为0.10%。
（一）方法提要试样中的低聚木糖经提取后在氨基色谱柱上分离，根据保留时间定性，用蒸发光散射检测器测定低聚木糖的含量。
（二）仪器1. 高效液相色谱仪带SEDEX 75蒸发光散射检测器。
2. 超声清洗仪。
3. 天平（精确到0.001g和0.0001g）。
4. 微孔滤膜（PVDF 0.45 μm）。
（三）试剂1. 色谱用水（Millipore纯水器制备）。
2. 乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL乙酸,加水溶解至100mL。
3. 亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解至100mL。
4.木二糖对照品，Wako公司(纯度≥90%)。
5. 木二糖标准溶液（10.0mg/mL）：精确称取50mg木二糖用蒸馏水定容至5mL 容量瓶中，即得木二糖标准溶液。
（四）测定步骤1. 样品处理：①固体样品：取均匀样品1.0g(精确到0.1mg)于150ml锥形瓶中，加水30ml，超声20min，再加入乙酸锌溶液，亚铁氰化钾溶液各2ml，摇匀后，经滤纸过滤到50ml 容量瓶中，用水定容到刻度。
取此滤液通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
②液体样品：取均匀试样10mL(精确到0.1mL)置于150ml锥形瓶中，加水20ml，超声20min，再加入乙酸锌溶液，亚铁氰化钾溶液各2ml，摇匀后，经滤纸过滤到50ml容量瓶中，用水定容到刻度。
取此滤液通过微孔滤膜过滤，滤液待用。
2. 标准工作曲线制作。
精密吸取木二糖标准溶液1.0 ml，5.0 ml，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容到100mL，摇匀。
分别取10μL标准工作系列溶液进样分析，以测得的木二糖的峰面积，分别对木二糖的浓度绘制标准曲线。
3．色谱条件①色谱柱：Cosmosil Sugar D 氨基液相色谱柱 250 mm i.d.×4.60mm, 5µm ； ②流动相：色谱用水＋乙腈=22+78(V+V)；③流速：1.0mL/min ；④柱温：35℃；⑤蒸发光散射检测器：蒸发温度35℃，压力 3.5Bar ；4. 样品测定。
保健食品中异麦芽糖低聚糖、低聚果糖、大豆低聚糖的测定保健食品中异麦芽低聚糖、低聚果糖、大豆低聚糖的测定1.范围本方法规定了保健食品中异麦芽低聚糖、低聚果糖、大豆低聚糖的测定方法。
本方法适用于保健食品（糖浆、糖粉、饮料、奶粉）中异麦芽低聚糖、低聚果糖、大豆低聚糖的测定。
本方法最低检出量：异麦芽糖2μg；潘糖5μg；异麦芽三糖10μg；蔗果三糖(GF2)5μg；蔗果四糖(GF3)5μg；蔗果五糖(GF4)10μg；棉籽糖20μg；水苏糖30μg。
2.原理试样除去蛋白后，离心、脱色，用液相色谱分析，用NH2柱分离，示差检测器测定，外标法定量。
3.试剂除特殊说明，所用试剂均为分析纯。
实验用水为去离子水或同等纯度的蒸馏水。
3.1乙腈（色谱纯）。
3.2无水乙醇。
3.3麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、棉籽糖、水苏糖(含量≥98%)3.4低聚果糖（总含量≥96%，其中GF238%，GF351%，GF47%）。
3.5麦芽糖、异麦芽糖混合标准溶液：分别称取麦芽糖10.0mg，异麦芽糖15.0mg，潘糖9.0mg，麦芽三糖15.0mg，异麦芽三糖12.0mg，用水溶解，并定容至1.0mL。
将此溶液逐级稀释成下列浓度：标准溶液名称：麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、麦芽三糖、异麦芽三糖（mg/mL）10.500.750.450.750.602 1.00 1.500.90 1.50 1.203 2.00 3.00 1.80 3.00 2.40410.0015.009.0015.0012.003.6低聚果糖标准溶液：精密称取含GF238%、GF351%、GF47%的低聚果糖标准品0.0500g，用水溶解并定容至2.50mL。
将此液逐级稀释成下列浓度：标准溶液名称：GF2、GF3、GF4（mg/mL）1 1.50 2.000.302 3.00 4.000.603 4.50 6.000.904 6.008.00 1.2057.5010.00 1.403.7棉籽糖、水苏糖标准溶液：精密称取棉籽糖0.0400g，水苏糖0.0600g，用水溶解并定容至4.0mL。
分析与检测在食品生产领域，低聚果糖（FOS）成为一种新型甜味剂，在乳制品、糖果、饮料中广泛应用。
检测食品中FOS的含量，对于控制食品质量具有重要意义。
1 材料和方法1.1 材料来源本研究材料是从市场上购买得到的某品牌奶粉和米粉。
1.2 仪器试剂仪器主要有：HPLC仪，蒸发光散射检测器，NH2色谱柱，离心机，超声波清洗器、电子天平等。
试剂主要有：GF2标品、GF3标品、GF4标品，乙腈，石油醚，乙酸锌与六氰合亚铁酸钾等。
1.3 溶液配制配制FOS标准溶液：取3个10 mL 容量瓶，分别精准称量GF2、GF3、GF4标品各200 g，将标品置于瓶内，加入超纯水直至刻度线，然后将其液稀释到不同浓度，分别是0.5、5、50 mg/mL，然后超声处理，时间为 3 min，经0.5 μm的滤膜过滤。
再取等量配好的标准溶液，置于容量瓶中，加入超纯水直至刻度线，重复超声、过滤的处理步骤，待检。
1.4 样品预处理脱脂。
取2个100 mL烧杯，精准称量奶粉、米粉各3.0 g，将其置于烧杯内，放在通风橱中；先加入50 mL 石油醚，进行超声处理，时间为20 min 再离心处理，转速为4 800 r/min、时间5 min；最后去除上层清液，留下沉渣在通风橱内挥发，于60 ℃下干燥，研磨为粉末状待检。
提取。
取样本粉末2.0 g，加入 20 mL蒸馏水，先进行超声提取，温度为60 ℃，时间15 min；再离心处理，转速为8 000 r/min，时间为5 min；取上层清液置于25 mL容量瓶内。
脱蛋白。
采用亚铁氰化钾-乙酸锌法，对样品溶液进行脱蛋白处理，然后离心，转速为8 000 r/min、时间5 min；取上层清液置于25 mL容量瓶内，加入蒸馏水定容。
1.5 HPLC色谱条件色谱柱是NH2分析柱，4.6 mm×300 mm，5 μm。
使用乙腈和水作为流动相，实施梯度洗脱，洗脱程序是：①前20 min，70%～65%的乙腈，30%～35%的水；②第20～22 min，65%的乙腈，35%的水；③第22～25 min，65%～70%的乙腈，35%～30%的水；④第25～28 min，70%的乙腈，30%的水。
