不同病理级别胶质瘤细胞中IDH1基因变异表达观察_郑勇
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IDH1 可 以 将 辅 酶 NADP＋还 原 成 NADPH。 而 NADPH 在 340nm 的 紫 外 光 下 有 特 定 的 吸 收 峰 。 IDH1 酶 活 力 以 在 25℃ 下 ， 每 毫 克 每 分 钟 催 化
NADP＋还原生成多少微摩尔 NADPH 来认定[3]。标本 组织细胞用 0.25％胰蛋白酶消化，4℃ 10000g 离心 10min，PBS 洗涤两次，0.1％Triton X-100 超声裂解， 12000g 离心 30min， 收集上层悬浮液 (含有 IDH1 酶)，测定蛋白浓度后，将含有相同量 IDH1 酶的悬 浮液加入 33mmol/L Tris buffer (pH 8.0)，100mmol/L 三 甲 基 甘 氨 酸 /氢 氧 化 钠 （pH 8.0），0.33 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L NADP+，1.33 mmol/L 二 氯 化 锰 ， 1.3mmol/L 异柠檬酸盐至 lmL。 整个反应是在 25℃ 下进行的，以加入 IDH 酶开始计时，使用分光光度 计及配套软件来分析计算每毫克每分钟催化 NADP 还 原 生 成 多 少 微 摩 尔 NADPH 来 计 算 酶 活 力。 1.2.3 统计学分析
《中国神经肿瘤杂志》 2012，10（3）： 143-146
143
·论著·
不同病理级别胶质瘤细胞中 IDH1 基因变异表达观察
郑 勇， 王继超， 杨小朋， 张 诚， 吴红星， 吴永刚， 杨 乐， 王 均 （新疆维吾尔自治区人民医院神经外科， 新疆 乌鲁木齐 830000）
【摘要】 背景与目的：胶质瘤是最常见的成人原发性神经系统恶性肿瘤，具有较高的病死率和病残率。 深入
采用 SPSS13.0 进行统计学分析。 不同级别胶 质瘤之间基因表达差异采用配对 t 检验分析；突变 组与对照组之间基因表达差异采用独立 t 检验分 析。 基因表达情况与病理级别间的关系采用 Spearman 等级相关分析法分析。 P< 0.05 为差异具 有统计学意义。
2结果
2.1 胶质瘤中 IDH1 突变情况 30 例 胶 质 瘤 标 本 中 ， 经 直 接 基 因 测 序 16 例
Parsons 等[4]首先对 22 例 GBM 的 20 661 个蛋 白编码基因测序，发现 12％患者在 IDH1 的活性位 点即 132 位点精氨酸发生了突变，90％突变为组氨 酸。 而研究报道中总共发现了 R132 位 6 种突变类 型 （R132H、R132C、R132S、R132G、R132L、R132V）, 本实验只发现了 R132H 类型， 可能与病例数较少 有关。 IDH1 位于 2q33 染色体，其产物在胞浆内参 与细胞代谢，与胶质瘤的发生、发展及预后密切相 关。 随后，一系列试验证实 IDHl 在胶质瘤中普遍存 在。
异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 （isocitrate dehydrogenase, IDH）催化异柠檬酸氧化脱羧作用产生 α-酮戊二酸
144
郑 勇，等. 不同病理级别胶质瘤细胞中 IDH1 基因变异表达观察
( alpha-ketoglutarate，α-KG)， 将烟酰胺腺嘌呤二核 苷 酸 磷 酸 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADP+)转化为 NADPH。 本研究分析不同病 理 级 别 胶 质 瘤 细 胞 IDH1 基 因 变 异 的 分 布 情 况 与 IDH1 基因变异后酶活性改变以及与其病理分级的 相关性，旨在初步阐明 IDH1 基因变异与胶质瘤发 生的相关性及其可能机制。
145
WHO Ⅳ 3 5 37.50%
系，这在近年的研究分析中，有了重大进展，但其发 生机制尚不明确。 全基因组突变分析[4]显示：一部分 胶质母细胞瘤患者 IDH1 的体细胞突变，常见于低 级别胶质瘤发展而来的继发性胶质瘤。 IDH1 基因 突变不仅出现在肿瘤晚期， 而且早期已经存在，先 于 1p 和 19q 缺失以及 TP53 突变[5]。 IDH 变异是恶 性胶质脑瘤最原始的基因突变，即癌变组织中每个 恶变的细胞内都发生了这一基因突变[6].
在 30 例标本中 ，16 例 IDH1 基 因 变 异 标 本 酶 活 力 测 定 值 为 13.74 ± 3.74μmol/（mg·min），14 例 野 生 型 标 本 酶 活 力 为 15.33±4.61μmol/（mg·min）， 二者比较差异有统计学差异 (P＜ 肿瘤，虽然 治疗方法有改善，但总体预后仍不理想，目前仍是 严重威胁人类健康的疾病。 IDH 虽是已被较深入研 究的蛋白， 但人们近年才发现 IDH 基因变异在胶 质瘤发生发展过程中可能起到重要的作用。
E-mail: xjzy3682@
基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（No. 2012211A087）
肿瘤，具有较高的病死率和病残率。 虽然目前随着 技术的发展，对胶质瘤的治疗手段、治疗水平已有 所提高， 但疗效预后改善不明显， 患者多预后不 佳[1,2]。 所以深入研究胶质瘤的发生发展，无论对于 其诊断还是治疗，都具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料 组织样本来自于 2011 年 1 月至 2011 年 11 月
新疆维吾尔自治区人民医院神经外科手术标本，相 关组织标本的使用已经获得新疆维吾尔自治区人 民医院伦理委员会批准， 并获得患者的知情同意。 男女比例为 1.3∶1。 年龄分布从 27 岁到 73 岁，平均 年龄为 45.3 ± 0.6 岁。 其中 WHO Ⅰ级 3 例，WHO Ⅱ级 12 例，WHO Ⅲ级 7 例，WHO Ⅳ级 8 例。 同时 收集 5 例脑外伤内减压手术所取正常脑组织(额叶 或颞叶)标本作为对照。 冰冻标本采集后均迅速置 于液氮中，-80℃冻存备用。 1.2 方法 1.2.1 PCR 检测 IDH1 基因多态性
研究胶质瘤的发生发展，无论对于其诊断还是治疗，都具有重要意义。 本文通过观察异柠檬酸脱氢酶 1（IDH1）基
因变异在不同病理级别胶质瘤中表达，初步分析 IDH1 基因变异与胶质瘤病理分级的相关性及意义。 方法：采用
直接测序法对 30 例不同病理级别胶质瘤标本进行 IDH1 基因变异检测， 并取 5 例外伤额颞叶减压脑组织标本
(1) DNA 提取用 Promega 公司 DNA 提取试剂 盒，按说明书提取 DNA，核酸定量仪测定 DNA 浓 度。
（2）PCR 扩 增 引 物 的 设 计 与 合 成: 序 列 为: 5'TGTGTTGAGATGGACGCCTATTTG 和 3'-TGCCACCAACGACCAAGTC。 反 应 条 件 : 95℃ 预 变 性 15min； 用 Touchdown PCR，94℃变性 50s，63~58℃ 退 火 1min (-0.5℃/min)，72℃延 伸 1min，共 循 环 10 次 ；94℃ 变 性 50s，57℃ 退 火 1min，72℃ 延 伸 1min， 共循环 30 次，最后于 72℃延伸 10min。
IDHI 基 因 突 变 与 胶 质 瘤 的 发 生 有 着 密 切 关
标本数
突变 野生 突变率
郑 勇，等. 不同病理级别胶质瘤细胞中 IDH1 基因变异表达观察
对照组 0 5 0
表 1 30 例胶质瘤标本 IDH1 突变情况
WHO Ⅰ 0 3 0
突变数 WHO Ⅱ
8 4 66.67%
WHO Ⅲ 5 2 71.43%
关键词: 胶质瘤； IDH1； 突变； 酶活力
中 图 分 类 号 ：R739.41
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：1726-8192（2012）03-00143-04
IDH1 mutation observed in different pathological grades of glioma cells
KEY WORDS: Glioma； IDH1； Mutation； Enzyme activity
胶质瘤是最常见的成人原发性神经系统恶性
收稿日期： 2012-07-02
修回日期： 2012-07-30
通讯作者： 郑 勇
Correspondence to: Yong Zheng
Tel: 86-991-8563682
(3)测 序 反 应 后 纯 化 及 基 因 测 序: PCR 产 物 用 V-GENE 公司提供 PCR 纯化试剂盒进行纯化。将纯 化后产物用 3100-Avant 遗传分析仪进行电泳
(4) 结果分析: 用 DNA sequencing analysis 5. 1 自动分析原始测序数据， 获得测序电泳图和序列， 样 品 序 列 用 DNA star seqman 及 ABI seqscape 软 件与标准序列进行比对，观察样本基因序列多态性 改变。 1.2.2 IDH1 酶活力测定
Yong Zhen, Ji-chao Wang, Xiao-peng Yang, Cheng Zhang, Hong-xing Wu, Yong-gang Wu, Le Yang, Jun Wang
Department of Neurosurgery, Xinjiang Autonomous Region people’s Hospital, Xinjiang 830000， P. R. China
（53.33%）发 生 IDH1 突 变 ，突 变 位 点 均 为 R132 型 （表 1）。 在各分级中，IDH1 突变发生率为：WHO Ⅱ 级 66.67% ，WHO Ⅲ 级 I 71.43% ，WHO Ⅳ 级 37.50%。 WHO Ⅰ级及对照组未见突变表达。 突变 率 较 对 照 组 差 异 均 有 统 计 学 意 义 （P < 0.05）。 Spearman 等级相关分析表明，IDH1 变异表达与胶 质瘤病理分级存在相关性（r=0.699， P=0.028)。 2.2 胶质瘤中 IDH1 酶活力
【ABSTRACT】 BACKGROUND & OBJECTIVE: Isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) gene mutation has been suggested to be associated with the development of glioma. In this article, we investigated the frequency of IDH1 mutation in different pathological grade gliomas. METHODS: IDH1 gene variant was detected by direct sequencing of 30 cases of different pathological grades of glioma specimens, and five cases of traumatic frontotemporal decompression brain tissue specimens were taken as controls. IDH1 enzyme activity in tumor tissue was measured by colorimetry. RESULTS: Among 30 cases of glioma, IDH1 gene mutation was found in 16 cases (53.33%), which was correlated with tumor grade. The mutated enzyme activity decreased significantly. CONCLUSION: The frequency of IDH1 gene mutation is high in gliomas and the enzyme activity decreased after the mutation.
NADP＋还原生成多少微摩尔 NADPH 来认定[3]。标本 组织细胞用 0.25％胰蛋白酶消化，4℃ 10000g 离心 10min，PBS 洗涤两次，0.1％Triton X-100 超声裂解， 12000g 离心 30min， 收集上层悬浮液 (含有 IDH1 酶)，测定蛋白浓度后，将含有相同量 IDH1 酶的悬 浮液加入 33mmol/L Tris buffer (pH 8.0)，100mmol/L 三 甲 基 甘 氨 酸 /氢 氧 化 钠 （pH 8.0），0.33 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L NADP+，1.33 mmol/L 二 氯 化 锰 ， 1.3mmol/L 异柠檬酸盐至 lmL。 整个反应是在 25℃ 下进行的，以加入 IDH 酶开始计时，使用分光光度 计及配套软件来分析计算每毫克每分钟催化 NADP 还 原 生 成 多 少 微 摩 尔 NADPH 来 计 算 酶 活 力。 1.2.3 统计学分析
《中国神经肿瘤杂志》 2012，10（3）： 143-146
143
·论著·
不同病理级别胶质瘤细胞中 IDH1 基因变异表达观察
郑 勇， 王继超， 杨小朋， 张 诚， 吴红星， 吴永刚， 杨 乐， 王 均 （新疆维吾尔自治区人民医院神经外科， 新疆 乌鲁木齐 830000）
【摘要】 背景与目的：胶质瘤是最常见的成人原发性神经系统恶性肿瘤，具有较高的病死率和病残率。 深入
采用 SPSS13.0 进行统计学分析。 不同级别胶 质瘤之间基因表达差异采用配对 t 检验分析；突变 组与对照组之间基因表达差异采用独立 t 检验分 析。 基因表达情况与病理级别间的关系采用 Spearman 等级相关分析法分析。 P< 0.05 为差异具 有统计学意义。
2结果
2.1 胶质瘤中 IDH1 突变情况 30 例 胶 质 瘤 标 本 中 ， 经 直 接 基 因 测 序 16 例
Parsons 等[4]首先对 22 例 GBM 的 20 661 个蛋 白编码基因测序，发现 12％患者在 IDH1 的活性位 点即 132 位点精氨酸发生了突变，90％突变为组氨 酸。 而研究报道中总共发现了 R132 位 6 种突变类 型 （R132H、R132C、R132S、R132G、R132L、R132V）, 本实验只发现了 R132H 类型， 可能与病例数较少 有关。 IDH1 位于 2q33 染色体，其产物在胞浆内参 与细胞代谢，与胶质瘤的发生、发展及预后密切相 关。 随后，一系列试验证实 IDHl 在胶质瘤中普遍存 在。
异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 （isocitrate dehydrogenase, IDH）催化异柠檬酸氧化脱羧作用产生 α-酮戊二酸
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郑 勇，等. 不同病理级别胶质瘤细胞中 IDH1 基因变异表达观察
( alpha-ketoglutarate，α-KG)， 将烟酰胺腺嘌呤二核 苷 酸 磷 酸 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADP+)转化为 NADPH。 本研究分析不同病 理 级 别 胶 质 瘤 细 胞 IDH1 基 因 变 异 的 分 布 情 况 与 IDH1 基因变异后酶活性改变以及与其病理分级的 相关性，旨在初步阐明 IDH1 基因变异与胶质瘤发 生的相关性及其可能机制。
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WHO Ⅳ 3 5 37.50%
系，这在近年的研究分析中，有了重大进展，但其发 生机制尚不明确。 全基因组突变分析[4]显示：一部分 胶质母细胞瘤患者 IDH1 的体细胞突变，常见于低 级别胶质瘤发展而来的继发性胶质瘤。 IDH1 基因 突变不仅出现在肿瘤晚期， 而且早期已经存在，先 于 1p 和 19q 缺失以及 TP53 突变[5]。 IDH 变异是恶 性胶质脑瘤最原始的基因突变，即癌变组织中每个 恶变的细胞内都发生了这一基因突变[6].
在 30 例标本中 ，16 例 IDH1 基 因 变 异 标 本 酶 活 力 测 定 值 为 13.74 ± 3.74μmol/（mg·min），14 例 野 生 型 标 本 酶 活 力 为 15.33±4.61μmol/（mg·min）， 二者比较差异有统计学差异 (P＜ 肿瘤，虽然 治疗方法有改善，但总体预后仍不理想，目前仍是 严重威胁人类健康的疾病。 IDH 虽是已被较深入研 究的蛋白， 但人们近年才发现 IDH 基因变异在胶 质瘤发生发展过程中可能起到重要的作用。
E-mail: xjzy3682@
基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（No. 2012211A087）
肿瘤，具有较高的病死率和病残率。 虽然目前随着 技术的发展，对胶质瘤的治疗手段、治疗水平已有 所提高， 但疗效预后改善不明显， 患者多预后不 佳[1,2]。 所以深入研究胶质瘤的发生发展，无论对于 其诊断还是治疗，都具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料 组织样本来自于 2011 年 1 月至 2011 年 11 月
新疆维吾尔自治区人民医院神经外科手术标本，相 关组织标本的使用已经获得新疆维吾尔自治区人 民医院伦理委员会批准， 并获得患者的知情同意。 男女比例为 1.3∶1。 年龄分布从 27 岁到 73 岁，平均 年龄为 45.3 ± 0.6 岁。 其中 WHO Ⅰ级 3 例，WHO Ⅱ级 12 例，WHO Ⅲ级 7 例，WHO Ⅳ级 8 例。 同时 收集 5 例脑外伤内减压手术所取正常脑组织(额叶 或颞叶)标本作为对照。 冰冻标本采集后均迅速置 于液氮中，-80℃冻存备用。 1.2 方法 1.2.1 PCR 检测 IDH1 基因多态性
研究胶质瘤的发生发展，无论对于其诊断还是治疗，都具有重要意义。 本文通过观察异柠檬酸脱氢酶 1（IDH1）基
因变异在不同病理级别胶质瘤中表达，初步分析 IDH1 基因变异与胶质瘤病理分级的相关性及意义。 方法：采用
直接测序法对 30 例不同病理级别胶质瘤标本进行 IDH1 基因变异检测， 并取 5 例外伤额颞叶减压脑组织标本
(1) DNA 提取用 Promega 公司 DNA 提取试剂 盒，按说明书提取 DNA，核酸定量仪测定 DNA 浓 度。
（2）PCR 扩 增 引 物 的 设 计 与 合 成: 序 列 为: 5'TGTGTTGAGATGGACGCCTATTTG 和 3'-TGCCACCAACGACCAAGTC。 反 应 条 件 : 95℃ 预 变 性 15min； 用 Touchdown PCR，94℃变性 50s，63~58℃ 退 火 1min (-0.5℃/min)，72℃延 伸 1min，共 循 环 10 次 ；94℃ 变 性 50s，57℃ 退 火 1min，72℃ 延 伸 1min， 共循环 30 次，最后于 72℃延伸 10min。
IDHI 基 因 突 变 与 胶 质 瘤 的 发 生 有 着 密 切 关
标本数
突变 野生 突变率
郑 勇，等. 不同病理级别胶质瘤细胞中 IDH1 基因变异表达观察
对照组 0 5 0
表 1 30 例胶质瘤标本 IDH1 突变情况
WHO Ⅰ 0 3 0
突变数 WHO Ⅱ
8 4 66.67%
WHO Ⅲ 5 2 71.43%
关键词: 胶质瘤； IDH1； 突变； 酶活力
中 图 分 类 号 ：R739.41
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：1726-8192（2012）03-00143-04
IDH1 mutation observed in different pathological grades of glioma cells
KEY WORDS: Glioma； IDH1； Mutation； Enzyme activity
胶质瘤是最常见的成人原发性神经系统恶性
收稿日期： 2012-07-02
修回日期： 2012-07-30
通讯作者： 郑 勇
Correspondence to: Yong Zheng
Tel: 86-991-8563682
(3)测 序 反 应 后 纯 化 及 基 因 测 序: PCR 产 物 用 V-GENE 公司提供 PCR 纯化试剂盒进行纯化。将纯 化后产物用 3100-Avant 遗传分析仪进行电泳
(4) 结果分析: 用 DNA sequencing analysis 5. 1 自动分析原始测序数据， 获得测序电泳图和序列， 样 品 序 列 用 DNA star seqman 及 ABI seqscape 软 件与标准序列进行比对，观察样本基因序列多态性 改变。 1.2.2 IDH1 酶活力测定
Yong Zhen, Ji-chao Wang, Xiao-peng Yang, Cheng Zhang, Hong-xing Wu, Yong-gang Wu, Le Yang, Jun Wang
Department of Neurosurgery, Xinjiang Autonomous Region people’s Hospital, Xinjiang 830000， P. R. China
（53.33%）发 生 IDH1 突 变 ，突 变 位 点 均 为 R132 型 （表 1）。 在各分级中，IDH1 突变发生率为：WHO Ⅱ 级 66.67% ，WHO Ⅲ 级 I 71.43% ，WHO Ⅳ 级 37.50%。 WHO Ⅰ级及对照组未见突变表达。 突变 率 较 对 照 组 差 异 均 有 统 计 学 意 义 （P < 0.05）。 Spearman 等级相关分析表明，IDH1 变异表达与胶 质瘤病理分级存在相关性（r=0.699， P=0.028)。 2.2 胶质瘤中 IDH1 酶活力
【ABSTRACT】 BACKGROUND & OBJECTIVE: Isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) gene mutation has been suggested to be associated with the development of glioma. In this article, we investigated the frequency of IDH1 mutation in different pathological grade gliomas. METHODS: IDH1 gene variant was detected by direct sequencing of 30 cases of different pathological grades of glioma specimens, and five cases of traumatic frontotemporal decompression brain tissue specimens were taken as controls. IDH1 enzyme activity in tumor tissue was measured by colorimetry. RESULTS: Among 30 cases of glioma, IDH1 gene mutation was found in 16 cases (53.33%), which was correlated with tumor grade. The mutated enzyme activity decreased significantly. CONCLUSION: The frequency of IDH1 gene mutation is high in gliomas and the enzyme activity decreased after the mutation.
