ELISA方法大全

ELISA方法类型及原理ELISA是一种重要的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质、抗体、荷尔蒙、生物学分子等。

ELISA的全称是酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），它通过将目标物（如抗原或抗体）与特定的酶标记物结合，然后利用染色反应来检测、定量或分析目标物。

根据目标物的不同，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA和反向ELISA等方法。

1.直接ELISA直接ELISA是最简单的一种ELISA方法。

它将目标物直接吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体来检测目标物。

具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性酶标记抗体，与目标物结合；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。

2.间接ELISA间接ELISA是较常用的一种ELISA方法。

它将目标物首先吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗来检测目标物。

具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性的初级抗体，与目标物结合；加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。

3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于定量测定样品中目标物含量的ELISA方法。

它将目标物预先包被在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体和待测样品，测定抗体与固相载体表面的目标物竞争的程度来定量目标物的含量。

具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物包被在载体表面；加入特异性酶标记抗体和待测样品；通过染色反应来检测酶的活性和竞争程度来定量目标物的含量。

4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理。

首先将目标物吸附在固相载体上，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗和待测样品。

Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。

Elisa的操作方法和常见问题对于熟练进行实验和解决实验中的问题都至关重要。

以下是Elisa的常见类型、实验标准操作方法以及常见问题的详细介绍。

一、常见类型：1. 间接Elisa：该方法利用抗体的特异性结合性质来检测特定抗原。

首先，在官网上涂上反应性抗原的试样，然后添加能与抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的二抗和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。

2. 直接Elisa：该方法利用特异性抗体与抗原的结合性质来检测特定抗原。

在官网上涂上反应性抗原的试样，然后加入能与抗原结合的标记抗体和标记物，最后通过颜色变化来测定抗原的含量。

二、实验标准操作方法：1.样品制备：收集要检测的样品，并进行必要的处理和制备，如离心、稀释等。

2.官网涂布：将样品或标准物质涂在官网上，并在适当的温度条件下孵育一段时间，使其抗原完全吸附到官网上。

3.阻断：用适当的阻断缓冲液或血清阻止非特异性结合。

4.添加（初级）抗体：加入特异性的初级抗体，让其与官网上的抗原结合。

5.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的初级抗体。

6.添加（二级）抗体：加入特异性的二级抗体，使其与初级抗体结合，并将标记物引入实验系统。

7.洗涤：用缓冲液洗涤掉未结合的二级抗体。

8.底物添加：加入含有底物的溶液，使底物被标记物催化，产生颜色反应。

9.反应终止：加入适当的溶液将反应停止。

10.测定：通过检测底物催化反应产生的颜色变化，使用酶标仪等设备测量并分析光密度。

三、常见问题：1.如何选择合适的抗体和标记物？2.如何优化实验条件？在实验过程中，可以通过优化浓度和孵育时间等条件来提高实验的敏感性和特异性。

可以尝试不同浓度的抗体和试剂，并对孵育时间和温度进行调整。

3.如何处理实验结果？实验结果通常会通过测量光密度来表示。

典型的Elisa实验结果可以使用标准曲线进行定量，或者通过比较样品和对照组的光密度差异来进行定性判断。

ELISA方法大全ELISA试剂盒种类繁多，根据原理可大致分为间接法、夹心法、竞争法、捕获包被法（也称为反向间接法，比较少见）。

其中各类型试剂盒的基本原理可以参考：【蛋白研究系列专题】-12丨ELISA方法知多少？（链接地址为：/s/PfZRQxBEP6cWt6FJyE7KXQ）以下为各类型ELISA试剂盒的抗原抗体连接顺序及适用类型：注：▌：吸附介质；/：竞争关系；-：结合Ag：抗原（antigen）；sAg：固相抗原；lAg：游离抗原（即待测抗原）；Ag*：酶标抗原Ab：抗体（antibody）；sAb：固相抗体；lAb：游离抗体（即待测抗体）；Ab*：酶标抗体（或酶标二抗）lIgM：游离IgM被测物以红色表示上面的方法涉及到的是比较简单的方式，在实际运用中则会进行一些改良，下面举几个栗子！直接法：直接用酶标抗体结合抗原，或者直接用酶标抗原结合抗体。

间接法：间接用酶标二抗结合特异性识别抗原的抗体。

下面的栗子帮助大家理解。

栗子1表中列出的两种夹心法属于直接夹心法，间接夹心ELISA则是基于两种不同种属来源的抗体，与直接法相比具有更高的灵敏度，常用来检测低丰度抗原样本。

间接夹心ELISA的抗原抗体连接顺序为：▌-sAb1(species 1)-lAg-Ab2(species 2)-Ab*，当然也不一定非要不同物种的抗体，使用同一物种的抗体也可以是这样的连接顺序：▌-sAb Fab-lAg-lAb(same species)-anti Fc Ab*。

栗子2竞争ELISA方法灵活性强，在实际应用中衍生出了许多不同的检测方式，除了表中列出的直接竞争法，还有间接竞争法、夹心竞争法等，这些方法是将间接法和夹心法进行重新组合得到的更为复杂的检测方法。

间接竞争法的抗原抗体连接顺序为：▌-sAg/lAg-Ab-Ab*，或者▌-sAg-Ab/lAb-Ab*酶标二抗。

这种方法比直接法进一步放大信号，故灵敏度更高。

夹心竞争法从原理上分可以有四种，实际中运用的多是：▌-sAb-Ag/lAg-Ab*，例如ICTP 检测试剂盒就是用这种方法开发的。

ELISA及相关免疫分析技术ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme-linked immunosorbent assay）是一种常用的免疫分析技术，用于检测和定量测定生物样本中的抗体或抗原。

ELISA是体外实验室诊断的重要工具，广泛应用于临床诊断、药物研发、环境监测和农业科学等领域。

ELISA的基本原理是利用抗原-抗体反应的特异性来检测和测定样品中的目标物。

ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接荧光ELISA等不同的变种方法。

下面将分别介绍这些方法的原理和应用。

1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法。

它使用固定在微孔板上的抗原与待测样品中的抗体结合，然后通过一个与抗体特异结合的酶标记二抗进行检测。

该方法适用于检测样品中的抗体。

2.间接ELISA：间接ELISA是一种常见的ELISA方法，用于检测样品中的抗原。

它首先在微孔板上固定抗原，接着加入待测样品，样品中的抗原与固定的抗原结合。

然后通过加入与抗体特异结合的二抗来检测抗原，该二抗被酶标记，在添加相应底物后可以通过测量底物的反应来定量抗原。

3.竞争ELISA：竞争ELISA用于测量样品中抗原或抗体的浓度。

它通过在固定在微孔板上的抗原与待测样品中的抗原或抗体竞争结合，来测定样品中的目标物浓度。

4.间接荧光ELISA：间接荧光ELISA是利用荧光信号来检测和测定样品中的抗体或抗原。

它与间接ELISA的原理类似，不同的是二抗被标记上荧光物质，通过测量荧光信号来定量目标物。

ELISA具有许多优点，例如灵敏度高、特异性强、操作简单、快速和成本低廉等。

它广泛应用于临床诊断中，如检测患者体液中的病原体抗体或抗原、监测药物浓度和筛选疫苗候选物。

此外，ELISA还可以应用于食品安全检测、环境监测和生物学研究等领域。

总而言之，ELISA是一种重要的免疫分析技术，广泛应用于不同领域的科学研究和临床实践中。

它的原理简单易懂，操作方便，同时具有高灵敏度和特异性，因此被认为是一种高度可靠和有效的生物分析工具。

ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理：1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。

该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。

2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。

该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。

3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。

酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。

4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。

操作步骤：1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。

将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。

2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。

3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。

4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。

5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。

6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。

7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。

8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。

9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。

10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。

ELISA基本方法ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

ELISA基本原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

ELISA基本操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.在包被溶液中稀释纯化的包被抗体（一般0.5-4μg/ml），将该稀释后的包被抗体100μl/孔加入到酶标板内。

2.用封板膜将板封好防止蒸发，在室温（或4℃）孵育过夜。

3.吸干每一板孔并加洗液洗涤，重复3次。

使用洗瓶、多道移液器、多功能分装器或洗板几，每孔加400μl彻底洗涤。

规范的操作要求每步完全移出孔中的液体。

最后一步，将板中液体移出并将板子在干净的纸巾上吸附。

4.加200-300μl/孔封闭液封板，室温至少孵育1小时。

5.重复步骤3，可利用真空泵干燥板子。

加入干燥剂并封板，至少在4-8℃可贮存2个月。

6.每孔加100μl适当稀释的标准品和标本，轻轻敲打板子1分钟。

贴上封板膜，室温孵育2小时。

7.重复步骤38.每孔加100μl经过适当稀释的生物素化的检测抗体，贴上新的封板膜，室温孵育2小时9.重复步骤310.每孔加100μl经过适当稀释的Avidin-HRP或 Streptavidin-HRP，也可加其它种类预先优化物11.重复步骤312.每孔加100μl底物溶液，避光，室温孵育5-30分钟进行显色反应13.每孔加50μl终止液，轻轻振荡板子确保充分混匀14.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶标检测）是用于检测免疫学反应的一种技术，全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA），该技术是测定抗体及抗原的特异性相互作用的一种常用的检测方法。

ELISA通过酶联试验来灵敏地检测特异性抗体或抗原的含量。

ELISA检测方法有很多种。

常用的ELISA检测方法有以下六种：一、双抗体沉淀反应ELISA（DAP-ELISA）双抗体沉淀反应ELISA是一种比较简单的ELISA方法，该方法的原理是，在受体表面点涂两种类型的抗体，例如兔抗人IgG，而免疫反应物则是人IgG，受体与免疫反应物结合后，形成抗体-抗原复合物，其上自发形成特异性沉淀。

随着浓度的增加，抗原越多，沉淀凝固物也越多，膜上形成沉淀下降，沉淀量可以通过酶标仪测定，或者免疫发光法检测，大体上，兔抗人IgG及抗原分别点涂及酶标探针可能以1:1:2的比例，也就是在100 L的反应液中加入到受体和兔抗人IgG各10 L，抗原20 L的条件下进行反应。

二、夹心ELISA（Sandwich ELISA）夹心ELISA是一种常见的ELISA检测方法，它利用特殊的标记抗体完成免疫反应，以达到检测目的。

以IgG为例，在受体表面点涂一种特异性抗体,如兔抗人IgG，受体与人IgG结合形成复合物，在这一抗原复合物上再添加第二种特异性抗体，如抗兔IgG，第二种抗体结合复合物，并将复合物结合在受体表面，形成抗原“夹心环”，该免疫反应体系可以通过酶标仪来检测指示物的夹心量，计算受体中抗原的含量。

三、竞争ELISA（Competitive ELISA）竞争ELISA提高ELISA检测的灵敏度，竞争式ELISA也属ELISA技术范畴，该技术通过特异性抗体与抗原间竞争性结合而形成的结果来检测特异性抗原的浓度。

竞争ELISA的原理是：将偶氮羟化物体表膜点涂含有特异性抗原区域的抗体，若添加一定量的抗原（相同的特异性抗原）至反应液，则可形成抗原-抗体复合物，受体与抗原的竞争性结合，而非特异性的抗体-抗原复合物。

简述elisa的四种方法类型
Elisa（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种受抗原特异性抗体促进酶链反应的免疫分析技术，应用非常广泛。

其中有四种主要类型：
1、酶连接免疫吸附试验（ELISA）：该类型ELISA以抗原为靶，以特异性抗体为解链剂，可以用于研究特定抗原之间的关系、表达以及联合的特性以及确定平衡状态。

2、双抗体免疫吸附试验（DASA）：该类型ELISA以抗原抗体复合物作为靶，应用特异性抗体进行解链，用于研究抗原-抗体复合物表达以及复合物稳定性，可用来测定特定抗原和抗体复合物的浓度。

3、酶联抗原免疫吸附试验（ELISA）：该类型ELISA是检测特定抗原的浓度，而不是其抗体复合物的浓度。

它利用特异性抗体识别特定抗原，并结合酶，加以反应以发出光学信号，从而实现抗原浓度的检测。

4、双抗体完全免疫吸附试验（DIAS）：这种ELISA技术中，使用一种特异性抗体与抗原结合以形成抗原抗体复合体，而另一种特异性抗体可以与该复合体结合，得到抗体抗体复合物以及特定浓度的抗原-抗体复合物，可用来研究特定抗原的表达率和稳定性。

ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定抗原或抗体的存在和浓度。

它的原理基于抗原和抗体之间的专一结合，利用酶标记的抗体或抗原来检测并定量目标物。

ELISA有多种不同的方法类型，以下将对其中六种方法类型及其原理进行详细介绍。

1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法，适用于寻找目标抗原。

在这种方法中，被测抗原直接吸附在固相或表面上，然后与特异性酶标记的抗原特异性结合。

最后，通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。

2.间接ELISA：间接ELISA也是常用的方法，适用于寻找目标抗体。

首先，将被测抗原吸附在固相或表面上，然后加入待测抗体。

之后，特异性结合的第二抗体（酶标记的）被加入用于识别和检测第一抗体。

最后通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。

3.竞争ELISA：竞争ELISA用于检测样品中的特定抗原或抗体。

在这种方法中，特异性酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗原或抗体竞争结合。

通过测定酶标记物的信号强度，可以确定待测样品中目标物的含量。

4.间接竞争ELISA：间接竞争ELISA是一种用于定量测定目标抗原的方法。

首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入特异性抗体。

该抗体与样品中的目标物竞争结合。

接着，再加入另一特异性抗体，该抗体与前面结合的抗体有竞争关系。

最后通过测定酶标记物的信号强度，可以确定目标物的浓度。

5.间接夹心ELISA：间接夹心ELISA用于寻找样品中的特定抗体。

首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入待测抗体。

随后，特异性酶标记的第二抗体被加入，用于识别和检测待测抗体。

最后通过测定酶标记物的信号强度，可以定量测定目标抗体的浓度。

6.双抗体ELISA：双抗体ELISA常用于寻找特定抗原。

首先，在固相或表面上吸附被测特异性抗体，然后加入样品。

目标抗原与抗体特异性结合。

接着，酶标记的第二抗体被加入，该抗体与目标抗原结合。

elisa常见实验方法摘要：1.ELISA实验原理简介2.ELISA实验步骤概述3.常见ELISA实验方法分类4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景5.提高ELISA实验效果的方法6.ELISA实验中常见问题及解决策略正文：ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于生物医学领域，用于检测蛋白质、抗原和抗体等生物分子的方法。

ELISA实验通过特异性抗体与待检测物结合，再通过酶标记的二抗检测结合物，从而实现对目标分子的定量分析。

以下是ELISA常见实验方法的详细介绍。

1.ELISA实验原理简介ELISA实验基于抗原抗体反应原理，将抗原或抗体固定在固相载体上，待检测样品中的目标分子与固定在载体上的抗体结合，再加入酶标记的二抗，与结合在载体上的抗原或抗体发生反应。

最后，通过底物显色反应，根据颜色的深浅判断待测物含量。

2.ELISA实验步骤概述ELISA实验一般分为以下四个步骤：（1）抗原或抗体固定：将抗原或抗体吸附在固相载体（如酶标板）上；（2）样品处理：对待测样品进行适当处理，使其与实验体系相适应；（3）加样：将处理后的样品和酶标记的二抗加入酶标板，incubate；（4）底物显色：加入底物，酶标记的二抗与抗原或抗体结合后，底物被酶催化显色；（5）读数：用酶标仪测定显色程度，换算成待测物浓度。

3.常见ELISA实验方法分类根据实验过程中抗原抗体结合的方式，ELISA实验可分为以下几类：（1）双抗原夹心法：待测物为抗原，实验中使用两种针对抗原不同表位的抗体；（2）竞争法：待测物为抗体，与固定抗原竞争结合酶标抗体；（3）间接法：待测物为抗体，通过酶标记的二抗检测；（4）免疫共沉淀法：利用抗原抗体结合后形成的免疫复合物与底物结合。

4.各类ELISA实验方法的优缺点及应用场景（1）双抗原夹心法：优点为特异性高、灵敏度高，适用于抗原含量较低的检测；缺点为操作复杂，易出现交叉反应。

（2）竞争法：优点为操作简便，适用于抗体含量较低的检测；缺点为特异性相对较低，易受其他物质干扰。