果树种质资源保存研究进展

曾斌，李健权，杨水芝，何科佳（湖南省园艺研究所，湖南长沙４１０１２５）

■一：从原生境与非原生境保存２方面出发，综述了在种子保存，离体保存和基因文库保存等果树种质资源保存技术方面取得的进展。针对我国果树种质资源保存现状，提出了国家还应加强种质资源圃和野生及其近缘植物保护区的建设，强化对资源的活体保护措施等。并指出保护重点可放在资源补充征集和保存设施的维护管理相结合的立体保存体系上，同时，也需探索更为安全、简便、实用、长期稳定的离体保存技术。关—Ｉ诩：果树；种质资源；保存；进展；综述中圈分类号：￥６０２．４文献标识码：Ａ文章■号：１００６－０６０Ｘ（２０１１）２２－００２２－０３

果树种质资源不仅是果树生产和科

研的物质基础，还是果树产业可持续

发展的前提和保障。我国被公认为是

世界上最大的栽培果树起源中心之一，

果树种质资源极其丰富，现已查明有５９

科１５８属６００多个种共ｌ万余个品种。但

由于近几十年来，环境不断恶化、土地

不断沙漠化以及人为破坏等因素，导致

部分果树种质资源锐减甚至灭绝；加上

果树优良品种的大面积推广，外来种入

侵、病虫天敌减少，以及农业机械化的

影响，导致果树的遗传基础正逐步趋向

单一化，这无疑增加了果树种质资源的

遗传脆弱性，因而给果树产业埋下了突

发毁灭性病害和优良基因缺失的巨大隐

患。近ｌＯ年来，我国越来越重视种质资

源的保护与保存，相关主管部门和科研

机构在建立果树种植资源保存体系和优

化创新种质资源保存技术等方面做了大

量工作，并取得了一定的成绩。

１果树种质资潭保存体系

１．１原生境保存

原生境保存一般指在植物原来的生

态环境中建立保护地或保护区，使植物

野生品种及野生近缘品种能就地自我繁

殖，该方式一般以国家级公园、国家级

自然保护区等为主体，如新疆新源县的

野果林带。近年来，我国也加强了对植

物原生境的保护工作。２００３～２００６年，

农业部在全国建立了６７个农业野生植物

原生境保护点，其中以保护野生果树为

重点的有４个。

收羲甘期：２０１１－０９－０６作者筒夼：－斌（１９７８－）。男．湖南长沙市人，助理研究员，主要研究方向为果树资深保存与创新．１．２非原生境保存

非原生境保存是指将种质保存于该

植物原产地以外的地方，包括异地活体

植株保存（资源圃）、种子保存（低温

库）、组织培养保存（试管种质库）和

设施内的超低温保存等。至今，我国建

有果树国家资源圃１６个，保存１９种果树

的种质资源１万余份，同时各级农业科研院所也积极收集和保存了相当数量的

果树种质资源，如武汉的砂梨资源圃、

重庆的柑橘资源圃等。同时，近年来各

高等院校和科研院所积极开展苹果、柑

橘等重要果树种质资源的离体保存的相

关研究和探索，取得了一定的进展并保

存了部分重要的种质资源。这项工作为

我国果树的育种和生产提供了雄厚的物

质基础与技术条件，也将为我国果树产

业的持续健康发展保驾护航。

２保存技术的研究进晨

目前，我国的果树种质保存技术研

究一般是围绕种子保存和离体保存这２

种非原生境保存技术来开展，目的是通

过人工创造的适宜环境使种质较长时间保存其遗传完整性，从而为使用者提供

有价值的种质材料。果树种质资源保存

技术的快速发展，为种质资源的长期保

存开辟了新途径。种子保存是一项简单

有效的方法，其主要应用于能够用种子保存且种子大多为‘‘ｊＥ常种子的种质。种

子库保存的种质，其生活力一般会随着贮

存期的延长而逐渐丧失，对不产生种子的

果树不能采取这种方式，因此离体保存

成为必不可少的技术手段。目前，离体

保存技术主要分为组织培养保存、超低

温保存和基因文库保存三大类。２．１种子保存

种子保存在果树上主要适用于野

生果树、砧木材料、无融合生殖等类

型，主要以种子繁殖为主的果树，如

椰子、杏、桃、核桃、番木瓜、板栗

等。种子保存中的关键因素是种子的含

水量，如将种子含水量控制在一定范

围（４％～６％），则可安全保存３０年以

上；经过常规干燥后就可进行超低温保

存，如用液氮保存种子。但是，这种保

存方法在种子保存上还有些缺陷，主要

是因为大多数水果的种子属于“顽拗性”

类型，在干燥过程中往往会发生脱水伤

害，导致种子活力降低，从而影响保存

效果，如荔枝种子，其含水量降至２８％

左右时就已经丧失发芽能力了。通常，

果树种子在保藏之前会采取一些辅助措

施，如唐林风等将木菠萝种子先经过部

分脱水处理，使其种皮趋于风干状态后

再置于能适度换气的塑料袋中于１５℃恒

温下湿藏，这样处理的种子保存时间由

自然条件下的１个多月延长至８００多天，

且种子发芽率仍可维持９０％以上。陆旺

金等的试验也证明，１００ｇ部分脱水、生理成熟期的黄皮种子用４～６ｇ百菌清处理后在１５℃下保存，种子８００天后仍

维持７０％的发芽率。由此可见，利用种

子本身的生理特性和遗传变异特性等来

改变保存条件或者控制保存环境，可使

其保存时间大大延长。但对于无性繁殖

居多或高度杂合的多倍体果树种质来

说，种子保存仍有一定的局限性。同

时，种子保存试验中以种子“最适含水

量”作为主要的判断依据还需进一步地

深入研究。

万方数据２．２组织培养保存

组织培养保存的材料一般为果树组

织、器官和细胞，包括试管苗、茎尖和分生组织、愈伤组织、胚、花粉等。该

方法因其无菌脱毒、空间利用率较高、

成本低等特点，成为中期保存种质资源

的首选方法。利用茎尖培养苗离体保存

果树种质资源，不仅可在高空间利用

率、低成本的情况下下保存大量稀有的

基因型种质和大量快速繁殖稀有种质，而且脱毒处理也能避免其他病原菌的感

染，便于种质的交换与发放，同时，还

可将组织培养的种质资源直接用作遗传

转化研究的材料，从而大大缩短培育新

品种的时间。因此，不能用常规方法

保存种子的植物多数可采用这种保存方式。至今，已经有ｌ０００多种植物和品

种成功应用此法保存，并取得了较好的

保存效果。

由于大多数植物组织培养都需要频

繁继代，所以常需要通过限制生长来延

长继代间隔。限制生长可以通过降低温度、提高渗透压、营养控制、添加生长

延缓剂或抑制剂、降低氧气浓度、减

少光照等手段来实现，延续继代周期，

达到长期保存果树种质资源的目的。Ｍｏｒｅｌ等用此方法较成功地保存了８００个

葡萄品种，却只用了２ｍ２的面积，每个

品种重复６次，每年只继代一次，成功

保存了１５年。在苹果、柑橘组织培养时，全部或部分蔗糖用甘露醇代替，并

采用低温及减少光照的方法，分别使苹

果试管苗、柑橘茎段的继代时间延长至

１２和１５个月。除保存技术外，影响种质资源中期保存效果的因素还有外植体类

型和生理状态、保存容器的类型、容积

和封口方法等。如陈振光于１９８５年将一批柑橘试管苗培养在２０℃、１２小时光

照条件下，不作转移继代培养，１３年后

仍存活。可见。保存过程中将各项辅助技术合理搭配，不但可以统一保存条

件，还能使各项技术优势互补，收到最

佳保存效果。２．３超低温保存

超低温保存是在一８０℃以下的超低

温介质中保存种质资源的方法。在超低温下，生物的代谢和衰老过程大大减慢

甚至完全停止，因此可长期保存植物材

料。该方式是目前唯一可行的、不需继

代的长期保存方式。超低温保存介质以液氮最为常用。超低温法可对果树多种

类型的材料进行保存，如愈伤组织、茎

尖、合子胚、胚状体、茎段等。目前，

超低温保存中悬浮细胞、原生质体、

芽和茎尖等分生组织已逐渐取代常用的

传统材料，如种子、花粉等。尤其是能

解决组织培养后代遗传稳定性问题的材料，如休眠芽和茎等，已成为果树种质

超低温保存中的主要材料。我国在苹果

离体茎尖、柑橘茎尖和原生质体、杏的

愈伤组织等，都有着非常成功的保存经

验。马峰旺等的研究表明，某些品种杏

的悬浮培养物分离的原生质体超低温保

存后存活率可达４０％。近年来，国内外

研究者对超低温保存技术中的各个技术

要点，如材料的选择和预处理、冰冻程序、冰冻材料的重新培养以及生活力或

存活率的测定等领域，都进行了大量细

致而深入的研究，并取得了一定的进

展。超低温保存早期一般采用程控降温

仪逐步降温，后来又发展了预培养法、脱水干燥法、包埋干燥法和玻璃化法。

玻璃化法经过玻璃化溶液处理和液氮的

骤然降温处理，可避免使用阶梯降温法

所需要的高性能程序降温设备和复杂的冷冻程序，是目前最为常用的方法。我

国在苹果、樱桃、柑橘等果树上已成功

地应用玻璃化法进行超低温保存，王子成等用玻璃化法保存柑橘茎尖２４小时

后解冻测定，存活率达１００％，培养再

生率达９０％。但在实际应用中，玻璃化

法也存在一定的局限性，如无法避免保护剂的化学毒性、降温过程过于严格、

保存样品的体积较小等。在此基础上研究出来的包埋玻璃化法，综合了两者的

优点，易于操作，存活率也高。张永卓

等采用包埋玻璃化法保存甜柿休眠芽的

茎尖，解冻后最高存活率为１００％，分化和再生情况正常。近年来，用这些保

存技术保存的果树已多达１００余种。但

目前的研究仍存在试验材料不够丰富、

材料遗传变异频繁等问题，并且大多研究仅限于实验室阶段，还不能应用于规

模生产。２．４基因文库保存

基因文库是将基因组聊峨酶切后嵌

入载体中，经体外包装，转染大肠杆菌后得到一组含不同ＤＮＡ片段的重组

颗粒。此文库包含了基因组内全部的

基因片段，能贮存基因组全部的序列信

息。遗传信息的获得、研究与利用可以

借助ＤＮＡ克隆等技术实现。这样建立起来的基因文库不仅可以长期保存果树

遗传资源，还可通过反复的培养以筛选

各种目的基因。基因文库保存能克服传

统保存利用效率低、工作量大、劳动强

度大、占地面积大、不易管理等不利因

素，正积极应用于果树资源的保存中，

并有望成为果树资源研究与利用的有力

工具。

３晨Ｉ

３．１大力加强果树种质资源的活体保存

近年来，我国作为世界上重要的果

树起源中心，在种质资源收集保存技术的研究上，都取得了瞩目的成绩。但我

国种质资源保存工作起步较晚，基础研

究仍相对落后。目前，我国已经初步形

成了果树种质资源保存体系，但仍有大

量资源由于没有稳定资金投入和完善的技术支撑，无法得到妥善保护和系统研

究。资源圃是目前维持植物遗传转化和

保存物种遗传特性最可靠、最安全的保

存方法。因此，我国还应加强种质资源

圃和野生及其近缘植物品种的原地自然

保护区建设，重点可放在资源补充征集

和保存设施的维护、管理上。

３．２深入应用离体保存技术

种质资源的离体保存相对于活体保

存在很多方面利用更广泛，优势也更突

出。今后可选择几种优先保存的种质资

源作为重点，利用目前较成熟的保存技术进行较大规模的中长期种质保存和遗

传稳定性试验，探讨长期稳定保存的可

行性，同时继续进行保存方法的优化研

究，探索更安全、实用、简便且长期稳

定的离体保存技术。上世纪７０年代以

一膏囊ｔ并事・下事一一广髑・２３万方数据