实验室细胞培养基本知识

细胞株(系)细胞复苏

(1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。

(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。

(3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。

(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。

注意事项

在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

细胞换液

（1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）

紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。将培养瓶放于37℃,5%CO2的培养箱内培养

培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无

血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在

改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。

一、基础培养基

绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基

酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基

是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而

Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有

无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取

1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——

DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度

高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形

下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这

种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能

有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元

生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒

效应。

在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因

为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的

培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若

培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM

含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度

下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究

之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。

原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓

度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与

碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在

DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识

培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。

一、基础培养基

绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。

在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。

原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。

细胞培养基的基本知识

培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血

清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中

包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。

一、基础培养基

绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素

和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的

混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须

氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。

MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s

改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成

分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情

形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养

基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损

伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中

时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。

在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有

不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培

养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏

时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要

用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的

组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也

能有比较令人满意的结果。

原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2

培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对

良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细