脲酶活性的测定

一、脲酶测定（比色法）脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6。

7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液）,保存于冰箱中.使用前,取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1。

9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0。

4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0。

1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理，加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7），仔细混匀.在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上)，摇荡，将悬液过滤.取滤液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10mL，然后加入4mL苯酚钠溶液，并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后，立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值.脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀，20min后显色,定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。

空白试验：不加尿素，其他同上。

品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。

•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。

四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。

尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。

实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。

反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。

反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。

按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。

三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。

2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。

3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。

4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。

5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。

6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。

此溶液含NH3为40μmol·mL-1。

7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。

一、实验目的1. 了解脲酶的基本性质及其催化反应原理。

2. 掌握脲酶活性测定的实验方法。

3. 通过实验验证脲酶活性受温度、pH值等因素的影响。

二、实验原理脲酶是一种水解脲的酶，可以将脲分解为氨和二氧化碳。

在酸性条件下，氨与苯酚反应生成蓝色络合物，通过测定蓝色络合物的吸光度，可以计算出脲酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：脲酶溶液、脲底物、苯酚、硫酸、NaOH、pH缓冲液、蒸馏水、移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。

2. 实验仪器：移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。

四、实验方法1. 配制脲酶溶液：取一定量的脲酶粉末，加入适量的蒸馏水溶解，配制成一定浓度的脲酶溶液。

2. 配制底物溶液：将脲底物与苯酚按照一定比例混合，加入适量的硫酸，配制成底物溶液。

3. 脲酶活性测定：a. 取一定量的脲酶溶液，加入底物溶液，混匀；b. 将混合液置于恒温水浴锅中，设定一定的温度；c. 在一定时间内，每隔一定时间取样，用紫外可见分光光度计测定吸光度；d. 根据吸光度计算脲酶活性。

五、实验结果与分析1. 温度对脲酶活性的影响：a. 在不同温度下（如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析温度对脲酶活性的影响。

2. pH值对脲酶活性的影响：a. 在不同pH值条件下（如pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析pH值对脲酶活性的影响。

六、实验结论1. 温度对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着温度的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适温度后，脲酶活性逐渐降低。

2. pH值对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着pH值的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适pH值后，脲酶活性逐渐降低。

七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制温度和pH值，以保证实验结果的准确性。

2. 操作过程中注意移液器的准确使用，避免污染和误差。

土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的方法，它可以测量土壤中脲酶的存在和活性。

这种方法通常使用一种叫做脲酶试剂盒的工具，该试剂盒中包含了所需的试剂和比色剂。

具体的测试步骤如下：
取一定量的土壤样品，并加入适量的水，搅拌均匀。

将混合物加入试剂盒中，加入脲酶试剂。

按照试剂盒中的说明，在一定的时间内进行反应。

比较样品的颜色和标准对照物的颜色，并记录下来。

根据脲酶试剂盒的不同，颜色的变化可能会有所不同。

一般来说，脲酶的存在和活性越高，样品的颜色就会越深。

通过对样品颜色的比较，就可以知道土壤中脲酶的存在和活性水平。

请注意，这种方法只能测量土壤中脲酶的活性水平，并不能测量脲酶的种类和数量。

土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的测量土壤中脲酶存在和活性的方法。

它使用脲酶试剂盒，包含所需试剂和比色剂。

测试步骤包括取样、加水搅拌、加入试剂盒、反应并比较颜色。

结果表明，脲酶存在和活性越高，样品颜色越深。

注意，这种方法只能测量脲酶活性水平，不能测量脲酶种类和数量。

脲酶活性测定（尿素残留量法）（Tabatabai，1994）1.原理：通过对新鲜土壤与尿素溶液在37︒C培养5h后测尿素残留量，估计脲酶的活性。

2. 仪器：50ml 容量瓶；培养箱或恒温水浴；沸水浴；分光光度计3. 试剂（所用试剂均为分析纯）1.) 尿素溶液：称取2.0 g 尿素，用700 ml 水溶解，定容1000 ml，低温保存备用。

2.) 氯化钾（2.0 mol L－1）－乙酸苯汞溶液：称1500g氯化钾溶于9L水中，再加入1L 乙酸苯汞（PMA）（称取50mg乙酸苯汞溶入1L水中）。

3.)显色剂：在进行显色反应之前，将25ml 二乙酰一肟和10ml 氨基硫脲加入到500ml 混酸溶液中，即配即用。

(a．二乙酰一肟（DAM）：称2.5g二乙酰一肟溶于100ml 水中; b.)氨基硫脲（TSC）溶液：称0.25g 氨基硫脲溶于100ml 水中; c.)混酸溶液：取磷酸（85％）600ml 和浓硫酸20ml，加入到200ml水中，再用水定容至1000ml。

)5.)尿素标准溶液：称干燥过的尿素0.2500g溶于约750ml的氯化钾－乙酸苯汞溶液中，并用该溶液定容至1L。

在冰箱中保存。

配制标准溶液系列：将尿素标准溶液用氯化钾－乙酸苯汞稀释10倍。

分别吸取0，1，2，4，6，8ml 该溶液至50 ml 容量瓶中，并用KCl－PAM 溶液补至10ml。

然后和样品同时加入显色剂30 ml、进行30 min沸水浴及冷却后定容和比色。

4. 步骤称取相当于5g干重的新鲜土样（＜2 mm ）放置于150 ml 具塞三角瓶中, 加入5 ml 尿素溶液(试剂1), 混匀,塞上瓶塞,在37 ︒C条件下培养5 h. 加入50 ml 的氯化钾-乙酸苯汞溶液,盖上瓶塞后在振荡机上振荡1h后过滤.分析仪上测定（或采用手动方法：吸取滤液1-2ml(最多含200μg尿素)放入50 ml 容量瓶中，并加入氯化钾-乙酸苯汞溶液10 ml 和显色剂30 ml。

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。

将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。

用2mL甲苯处理15分钟。

往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。

仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。

与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。

培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。

摇匀，将悬液过滤。

吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。

然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。

一、实验目的1. 了解脲酶的催化特性。

2. 掌握脲酶活性测定的原理和方法。

3. 分析不同条件下脲酶活性的变化。

二、实验原理脲酶是一种水解酶，能催化脲分解为氨和二氧化碳。

本实验通过测定不同条件下脲酶活性，探讨温度、pH值、抑制剂等因素对脲酶活性的影响。

三、实验材料1. 试剂：脲酶、尿素、NaOH、HCl、邻苯二甲酸氢钾、硫酸铜、碘化钾、淀粉、氯化钠等。

2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、pH计、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 脲酶活性测定(1) 准备脲酶工作液：取一定量的脲酶，用蒸馏水稀释至一定浓度。

(2) 配制脲酶反应体系：取一定量的脲酶工作液，加入尿素溶液，混合均匀。

(3) 加入指示剂：取少量淀粉溶液，加入反应体系中。

(4) 水浴加热：将反应体系置于恒温水浴锅中，保持一定温度。

(5) 定时取样：每隔一定时间，取少量反应液，加入碘化钾溶液，观察颜色变化。

(6) 记录结果：记录反应液颜色变化所需时间，根据标准曲线计算脲酶活性。

2. 温度对脲酶活性的影响(1) 设置不同温度：设置0℃、25℃、37℃、50℃、75℃等不同温度。

(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。

(3) 记录结果：记录不同温度下脲酶活性。

3. pH值对脲酶活性的影响(1) 设置不同pH值：设置pH 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0等不同pH值。

(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。

(3) 记录结果：记录不同pH值下脲酶活性。

4. 抑制剂对脲酶活性的影响(1) 设置不同抑制剂浓度：设置0.1%、0.5%、1.0%、2.0%等不同抑制剂浓度。

(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。

(3) 记录结果：记录不同抑制剂浓度下脲酶活性。

五、实验结果与分析1. 脲酶活性测定结果根据标准曲线计算得到脲酶活性，结果如下表所示：| 时间（min） | 脲酶活性（U/mL） || :--------: | :--------------: || 0 | 0.00 || 5 | 0.25 || 10 | 0.50 || 15 | 0.75 || 20 | 1.00 |2. 温度对脲酶活性的影响不同温度下脲酶活性如下表所示：| 温度（℃） | 脲酶活性（U/mL） || :--------: | :--------------: || 0 | 0.10 || 25 | 0.60 || 37 | 1.20 || 50 | 0.40 || 75 | 0.20 |结果表明，脲酶活性在37℃时最高，随温度升高或降低，脲酶活性逐渐降低。