脲酶活性的测定

一、脲酶测定（比色法）脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6。

7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液）,保存于冰箱中.使用前,取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1。

9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0。

4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0。

1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理，加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7），仔细混匀.在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上)，摇荡，将悬液过滤.取滤液1mL置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10mL，然后加入4mL苯酚钠溶液，并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后，立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值.脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀，20min后显色,定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。

空白试验：不加尿素，其他同上。

品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。

•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。

四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。

尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。

实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。

反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。

反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。

按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。

三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。

2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。

3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。

4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。

5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。

6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。

此溶液含NH3为40μmol·mL-1。

7 、纳氏试剂：分别溶解3 . 5g 氯化高汞（HgCl2）于20mL热蒸馏水，10g碘化钾于5 mL水中，再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中，不断搅拌，直至出现微红色的少量沉淀为止。

一、实验目的1. 了解脲酶的基本性质及其催化反应原理。

2. 掌握脲酶活性测定的实验方法。

3. 通过实验验证脲酶活性受温度、pH值等因素的影响。

二、实验原理脲酶是一种水解脲的酶，可以将脲分解为氨和二氧化碳。

在酸性条件下，氨与苯酚反应生成蓝色络合物，通过测定蓝色络合物的吸光度，可以计算出脲酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：脲酶溶液、脲底物、苯酚、硫酸、NaOH、pH缓冲液、蒸馏水、移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。

2. 实验仪器：移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。

四、实验方法1. 配制脲酶溶液：取一定量的脲酶粉末，加入适量的蒸馏水溶解，配制成一定浓度的脲酶溶液。

2. 配制底物溶液：将脲底物与苯酚按照一定比例混合，加入适量的硫酸，配制成底物溶液。

3. 脲酶活性测定：a. 取一定量的脲酶溶液，加入底物溶液，混匀；b. 将混合液置于恒温水浴锅中，设定一定的温度；c. 在一定时间内，每隔一定时间取样，用紫外可见分光光度计测定吸光度；d. 根据吸光度计算脲酶活性。

五、实验结果与分析1. 温度对脲酶活性的影响：a. 在不同温度下（如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析温度对脲酶活性的影响。

2. pH值对脲酶活性的影响：a. 在不同pH值条件下（如pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析pH值对脲酶活性的影响。

六、实验结论1. 温度对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着温度的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适温度后，脲酶活性逐渐降低。

2. pH值对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着pH值的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适pH值后，脲酶活性逐渐降低。

七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制温度和pH值，以保证实验结果的准确性。

2. 操作过程中注意移液器的准确使用，避免污染和误差。

NH2CONH2+ 尿素酶 2NH3 ↑ + CO2
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三、仪器及试剂
1、仪器
分析天平、样品粉碎机、样品分析 筛、恒温水浴、酸度计、称量瓶、 移液管、角匙等
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2、试剂 0.05mol/L磷酸盐缓冲液、尿素缓
冲溶液等
四、试样的选取和制备
选取具有代表性的试样，粉碎至40 目，用“四分法”缩减至200～300g， 密闭保存，以防试样组分变化或变质。
3、样品试验与空白试验的制备应相 隔5分钟，并且每隔5分钟搅拌内容 物一次。
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4、30分钟后，相隔5分钟将样品与空 白试验的称量瓶从水浴中取出，将上 层液体移入5ml烧杯中，在从水浴中 取出刚达5分钟时，分别测定此种上 层液体的PH值。
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六、结果的计算
1、计算公式： 样品试验的PH值与空白试验的PH值
BACK 第11页，本讲稿共12页
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脲酶活性的测定
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一、实验目的
1、掌握大豆制品中脲酶活性的测定 原理
2、熟悉掌握用PH增值法测定大豆 制品中脲酶活性
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二、 测定原理
将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶 液混合，在30℃保持30分钟，尿素酶催化 尿素水解产生氨，由于尿素水解释放的氨 是碱性的，可使溶液PH值升高，试样溶液 与空白溶液的PH值之差，即可间接表示出 氨量的多少。
脲酶测定animalscience动物营养与饲料学脲酶测定animalscience动物营养与饲料学脲酶测定animalscience动物营养与饲料学脲酶测定animalscience动物营养与饲料学11样品试验的样品试验的phph值与空白试验的值与空白试验的phph值值两者之间的差异则为脲酶活性的指数两者之间的差异则为脲酶活性的指数脲酶活性脲酶活性试样的试样的phph测定值测定值空白的空白的phph测定值测定值脲酶测定animalscience动物营养与饲料学每个样品应取两个平行样测定每个样品应取两个平行样测定以其算术平均值为结果

土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的方法，它可以测量土壤中脲酶的存在和活性。

这种方法通常使用一种叫做脲酶试剂盒的工具，该试剂盒中包含了所需的试剂和比色剂。

具体的测试步骤如下：
取一定量的土壤样品，并加入适量的水，搅拌均匀。

将混合物加入试剂盒中，加入脲酶试剂。

按照试剂盒中的说明，在一定的时间内进行反应。

比较样品的颜色和标准对照物的颜色，并记录下来。

根据脲酶试剂盒的不同，颜色的变化可能会有所不同。

一般来说，脲酶的存在和活性越高，样品的颜色就会越深。

通过对样品颜色的比较，就可以知道土壤中脲酶的存在和活性水平。

请注意，这种方法只能测量土壤中脲酶的活性水平，并不能测量脲酶的种类和数量。

土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的测量土壤中脲酶存在和活性的方法。

它使用脲酶试剂盒，包含所需试剂和比色剂。

测试步骤包括取样、加水搅拌、加入试剂盒、反应并比较颜色。

结果表明，脲酶存在和活性越高，样品颜色越深。

注意，这种方法只能测量脲酶活性水平，不能测量脲酶种类和数量。

脲酶活性测定（尿素残留量法）（Tabatabai，1994）1.原理：通过对新鲜土壤与尿素溶液在37︒C培养5h后测尿素残留量，估计脲酶的活性。

2. 仪器：50ml 容量瓶；培养箱或恒温水浴；沸水浴；分光光度计3. 试剂（所用试剂均为分析纯）1.) 尿素溶液：称取2.0 g 尿素，用700 ml 水溶解，定容1000 ml，低温保存备用。

2.) 氯化钾（2.0 mol L－1）－乙酸苯汞溶液：称1500g氯化钾溶于9L水中，再加入1L 乙酸苯汞（PMA）（称取50mg乙酸苯汞溶入1L水中）。

3.)显色剂：在进行显色反应之前，将25ml 二乙酰一肟和10ml 氨基硫脲加入到500ml 混酸溶液中，即配即用。

(a．二乙酰一肟（DAM）：称2.5g二乙酰一肟溶于100ml 水中; b.)氨基硫脲（TSC）溶液：称0.25g 氨基硫脲溶于100ml 水中; c.)混酸溶液：取磷酸（85％）600ml 和浓硫酸20ml，加入到200ml水中，再用水定容至1000ml。

)5.)尿素标准溶液：称干燥过的尿素0.2500g溶于约750ml的氯化钾－乙酸苯汞溶液中，并用该溶液定容至1L。

在冰箱中保存。

配制标准溶液系列：将尿素标准溶液用氯化钾－乙酸苯汞稀释10倍。

分别吸取0，1，2，4，6，8ml 该溶液至50 ml 容量瓶中，并用KCl－PAM 溶液补至10ml。

然后和样品同时加入显色剂30 ml、进行30 min沸水浴及冷却后定容和比色。

4. 步骤称取相当于5g干重的新鲜土样（＜2 mm ）放置于150 ml 具塞三角瓶中, 加入5 ml 尿素溶液(试剂1), 混匀,塞上瓶塞,在37 ︒C条件下培养5 h. 加入50 ml 的氯化钾-乙酸苯汞溶液,盖上瓶塞后在振荡机上振荡1h后过滤.分析仪上测定（或采用手动方法：吸取滤液1-2ml(最多含200μg尿素)放入50 ml 容量瓶中，并加入氯化钾-乙酸苯汞溶液10 ml 和显色剂30 ml。

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。

将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。

用2mL甲苯处理15分钟。

往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。

仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。

与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。

培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。

摇匀，将悬液过滤。

吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。

然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。

一、实验目的1. 了解脲酶的催化特性。

2. 掌握脲酶活性测定的原理和方法。

3. 分析不同条件下脲酶活性的变化。

二、实验原理脲酶是一种水解酶，能催化脲分解为氨和二氧化碳。

本实验通过测定不同条件下脲酶活性，探讨温度、pH值、抑制剂等因素对脲酶活性的影响。

三、实验材料1. 试剂：脲酶、尿素、NaOH、HCl、邻苯二甲酸氢钾、硫酸铜、碘化钾、淀粉、氯化钠等。

2. 仪器：分光光度计、恒温水浴锅、pH计、移液器、试管等。

四、实验步骤1. 脲酶活性测定(1) 准备脲酶工作液：取一定量的脲酶，用蒸馏水稀释至一定浓度。

(2) 配制脲酶反应体系：取一定量的脲酶工作液，加入尿素溶液，混合均匀。

(3) 加入指示剂：取少量淀粉溶液，加入反应体系中。

(4) 水浴加热：将反应体系置于恒温水浴锅中，保持一定温度。

(5) 定时取样：每隔一定时间，取少量反应液，加入碘化钾溶液，观察颜色变化。

(6) 记录结果：记录反应液颜色变化所需时间，根据标准曲线计算脲酶活性。

2. 温度对脲酶活性的影响(1) 设置不同温度：设置0℃、25℃、37℃、50℃、75℃等不同温度。

(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。

(3) 记录结果：记录不同温度下脲酶活性。

3. pH值对脲酶活性的影响(1) 设置不同pH值：设置pH 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0等不同pH值。

(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。

(3) 记录结果：记录不同pH值下脲酶活性。

4. 抑制剂对脲酶活性的影响(1) 设置不同抑制剂浓度：设置0.1%、0.5%、1.0%、2.0%等不同抑制剂浓度。

(2) 按照脲酶活性测定步骤进行实验。

(3) 记录结果：记录不同抑制剂浓度下脲酶活性。

五、实验结果与分析1. 脲酶活性测定结果根据标准曲线计算得到脲酶活性，结果如下表所示：| 时间（min） | 脲酶活性（U/mL） || :--------: | :--------------: || 0 | 0.00 || 5 | 0.25 || 10 | 0.50 || 15 | 0.75 || 20 | 1.00 |2. 温度对脲酶活性的影响不同温度下脲酶活性如下表所示：| 温度（℃） | 脲酶活性（U/mL） || :--------: | :--------------: || 0 | 0.10 || 25 | 0.60 || 37 | 1.20 || 50 | 0.40 || 75 | 0.20 |结果表明，脲酶活性在37℃时最高，随温度升高或降低，脲酶活性逐渐降低。

对于脲酶，它能促使尿素水解转化成氨、二氧化碳，反应 如下 :
在土壤中，在pH值为6.5~7.0是脲酶活性最大，通过测定 释放出的NH3量，可以确定脲酶的活性。土壤中脲酶活性 一般以37℃培养48小时每克土壤释放出的NH3–N毫克数 表示。
三、步骤概要
1、取二个250ml锥形瓶，各加入10.0克土壤，再各加入 10ml混合磷酸盐缓冲溶液（pH6.8）。摇动处理15分钟， 使均匀。在往第一瓶内加入10ml浓度10%的尿素溶液， 再经屏内容物充分混匀，作为试样。第二瓶内加入10ml 蒸馏水，作为对照。将两个瓶置于37℃培养箱中培养48 小时（要塞上纱布塞子）。 2、培养结束后，往两个瓶内各加入50ml 2N KCL 溶液。塞 紧后再振荡30分钟。到时立即将试样过滤（滤纸可以用蒸 馏水润湿）到蒸氨瓶内。
实验一 土壤脲酶活性测定
一、实验目的
1. 掌握土壤脲酶活性测定第一种方法，了解所取土壤的脲酶 活性。 2. 了解尿素这一有机物在土壤环境中的降解转化。
二、简单原理
酶是一类具有蛋白质性质的、高分子的生物催化剂。土 壤酶 是活的有机体所合成的，或者在其生长过程中分泌 与体外，或者在其死亡后自溶而释放出。所有的酶均能显 示其活性。显著的酶的特征之一是其催化反应的专一性。 例如，脲酶对尿素的催化降解就及其专一。土壤中的酶的 来源有二种。一是来自于高等植物根系分泌及土壤中动植 物残体分解。二是来源于土壤微生物的生命活动。土壤酶 可分为胞内酶和胞外酶两种。胞外酶或溶出后的胞内酶进 入土壤结构后，均具有相对稳定性，如能抗微生物分解和 抗热稳定性等。它们以三种形式存在于土壤中，一是以吸 附状态贮积于土壤中。二是于土壤腐殖质复合存在。三是 以游离状态存在。
四、计算
式中，W为称取的样品重（氨外，还能有什么方法可以测定 脲酶的活性？ 2、实验中为什么要加入甲苯？ 3、步骤4中为什么要迅速加入NaOH？ 4、如果蒸氨时吸收液倒吸到冷凝管中如何解决？

MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性 pH增值法盐酸中和法MM_FS_CNJ_0315出口大豆饼粕脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法1.适用范围本方法适用于大豆饼粕类脲酶活性的测定。

2.方法一2.1.术语脲酶活性：在规定的操作条件下，使试样中的脲酶分解尿素释放出氨基氮，以溶液pH值的变量表示。

2.2.原理概要将研细的试样与缓冲尿素溶液混合，在30℃作用30min后，测定溶液的pH值。

2.3.主要试剂和仪器2.3.1.主要试剂磷酸缓冲溶液：将3.403g KH2PO4和4.355g K2HPO4溶解并稀释至1000mL。

临用前，以强酸或强碱调节其pH至7.0，其使用期限不超过90d；缓冲的尿素溶液：溶15g尿素（NH2CONH2）于500mL磷酸缓冲溶液中。

加入5mL甲苯，用于防腐和防止霉菌生长。

按上法调节其pH至7.0。

2.3.2.仪器分析天平：感量0.1mg；研磨器：易于清理，研磨过程中不发热，并能达到要求的磨粉细度；恒温水浴：能控制于30±0.5℃；pH计：备有玻璃电极和甘汞电极，灵敏度不低于±0.02pH单位，同时附有温度补偿；试管：直径22mm，长150mm，具橡胶塞；烧杯：容量10mL；单刻度移液管：10mL；精密计时器；标准筛。

2.4.试样的制备用研磨器将约10g的样品，在不升高温度的条件下尽可能研细，使其通过60目标准筛的量不少于60％。

收集全部磨碎物于广口瓶中，小心混合并立即进行分析。

2.5.过程简述准确称取试样0.200g，放入试管内，加10mL缓冲的尿素溶液，塞好橡胶塞，混匀。

置于30±0.5℃水浴中，记下时间。

隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。

另称试样0.200g，放另一试管内，加10mL磷酸缓冲溶液，塞好橡胶塞，混匀，作为空白试验。

与上管间隔5min置于同一水浴中。

在消化过程中，每隔5min将试管内容物都摇匀一次。

磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于 水并稀释至1000mL，再将30g尿素 溶于此缓冲溶液中，
（4）注意事项： • 1.粉碎样品时，不应产生大量热，
否则会影响结果判定； • 2.称量样品时，一定要将样品混合
均匀，否则会造成试验误差； • 3.试样和空白试验同时操作，过程
要迅速，防止时间影响。
2、尿素酚红法 （1）原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2
时由黄变红，大豆制品中所含的尿 素酶可将尿素水解产生氨，释放的 氨可使酚红指示剂变红，根据变红 样品占所有样品的比例来判断脲酶 活性的大小。
（2）仪器和试剂： • 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热 • 分析天平：感量0.01g • 25ml纳式比色管 • 恒温水浴锅 • 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于
100ml 95%乙醇溶液 • 结晶尿素：分析纯
（3）方法：
粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）；
•1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，
最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。

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4、30分钟后，相隔5分钟将样品与空 白试验的称量瓶从水浴中取出，将 上层液体移入5ml烧杯中，在从水 浴中取出刚达5分钟时，分别测定 此种上层液体的PH值。
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Department of Animal scien握大豆制品中脲酶活性的测 定原理 2、熟悉掌握用PH增值法测定大豆 制品中脲酶活性
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二、 测定原理
将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶 液混合，在30℃保持30分钟，尿素酶催化 尿素水解产生氨，由于尿素水解释放的氨 是碱性的，可使溶液PH值升高，试样溶液 与空白溶液的PH值之差，即可间接表示出 氨量的多少。 NH2CONH2+ 尿素酶 2NH3 ↑ + CO2
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七、注意事项
1、关于酸度计的使用
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2、称量瓶应塞紧 3、关于固定质量称量法 4、通常： 0.02<△PH≤0.3 加工适度 △PH<0.02 加工过度 △PH>0.3 加工不够
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六、结果的计算
1、计算公式：
样品试验的PH值与空白试验的PH值 两者之间的差异，则为脲酶活性的指数， 即：
脲酶活性 = 试样的PH测定值-空白的PH测定值

脲酶的测定脲酶是一种重要的酶类物质，它在生物体内起着关键的催化作用。

脲酶的测定是一项常用的实验方法，可以用于研究酶的活性以及相关的生物化学过程。

本文将介绍脲酶的测定方法及其应用。

一、脲酶的概述脲酶是一类具有相似结构和功能的酶，可以催化脲的水解反应，将脲转化为尿素和氨。

脲酶在生物体内广泛存在，不仅参与氮代谢过程，还与多种生物学功能密切相关，如参与DNA修复、细胞凋亡等。

常用的脲酶测定方法有光度法、电化学法和荧光法等。

以下将分别介绍这些方法的原理和操作步骤。

1. 光度法光度法是一种基于物质吸收光的强度与其浓度成正比关系的测定方法。

脲酶测定中常用的底物是尿素，通过测定产生的尿素浓度变化来间接测定脲酶的活性。

操作步骤：（1）取适量的样品，并加入适量的底物溶液；（2）在一定的温度下，反应一段时间；（3）加入某种试剂，使产生的尿素与试剂发生反应，并形成有色产物；（4）通过测定产生的有色产物的吸光度，计算出脲酶的活性。

2. 电化学法电化学法是利用电极的电化学反应与脲酶的活性变化相关联，从而测定脲酶的浓度。

常用的电化学方法有循环伏安法、方波伏安法等。

操作步骤：（1）将电化学电极放置在含有脲酶底物的溶液中；（2）在一定的电压范围内，记录电流与电压的变化曲线；（3）根据电流与电压的变化关系，计算出脲酶的浓度。

3. 荧光法荧光法是利用脲酶底物与某种荧光试剂反应产生荧光信号的变化来测定脲酶的活性。

该方法具有高灵敏度和高选择性的特点。

操作步骤：（1）将含有脲酶底物和荧光试剂的溶液置于荧光分析仪中；（2）激发荧光试剂产生荧光信号；（3）测定荧光信号的强度变化，计算出脲酶的活性。

三、脲酶的应用脲酶作为一种重要的酶类物质，在医学、生物学和农业等领域有着广泛的应用。

1. 医学应用脲酶的活性与多种疾病的发生和发展密切相关，如肾功能衰竭、尿毒症和某些肿瘤等。

通过测定脲酶的活性，可以对这些疾病进行早期诊断和监测。

2. 生物学研究脲酶参与了许多生物学过程，如DNA修复、细胞凋亡等。

土壤脲酶活性测定（NH 4+释放量法）脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。

土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。

脲酶催化尿素的水解反应：22232H NCONH +H O 2NH +CO −−−→脲酶在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。

脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。

脲酶含有镍，分子量在151，000 Da ～480，00 Da 之间。

能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。

1. 试验原理通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h 后测定氨释放量，估计脲酶的活性 (Tabatabai, 1994)。

2. 试验仪器50mL 容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。

3. 试验试剂（所用试剂均为分析纯）a. 甲苯（C 6H 5CH 3）;b. 缓冲液：三（羟甲基）氨基甲烷[c （C 2H 8O 3N 3）=0.05mol ·L -1, pH9.0]：称取6.1g 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane ）溶入700mL 蒸馏水中，用c （H 2SO 4）=0.2mol ·L -1的硫酸溶液调pH 至9.0，再用蒸馏水定容至1000mL;c. 尿素溶液{c [CO(NH 2)2]=0.2 mol ·L -1}：称取1.2g 尿素溶入约80mL 缓冲液中，后用该缓冲液定容至100mL 。

尿素溶液要当天配制，并在4℃下保存备用；d. 氯化钾硫酸银混合溶液[c （KCl ）＝2.5mol·L -1]－[ρ（Ag 2SO 4）=100mg·L -1]：先将100mg Ag 2SO 4溶于700mL 蒸馏水中，再加入188g 的KCl （分析纯）使之溶解，在定容至1000mL ；e. 氧化镁（MgO ）：于高温电炉中，将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h ，再放置于干燥器中冷却，贮于瓶中；f. 混合指示剂：溶解0.099g 的溴甲酚绿和0.066g 甲基红于100mL 的乙醇（95％纯度）中；g. 硼酸指示剂溶液[ρ（H 3BO 3）=20g·L -1]：溶解20g 硼酸于950mL 的热蒸馏水中，冷却，加入20mL 的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液[c (NaOH)=0.1mol·L -1],直至溶液呈红紫色（pH 约4.5），稀释成1L ；h. 硫酸标准溶液[c （1/2H 2SO 4）=0.005mol ·L -1]。

第1篇一、目的本规程旨在规范脲酶试验的操作流程，确保试验结果的准确性和可靠性。

二、原理脲酶是一种催化脲分解成氨和二氧化碳的酶。

在本试验中，脲酶将脲分解，产生的氨与酸化后的水杨酸酚反应，生成紫色化合物，通过比色法测定脲酶的活性。

三、试剂与材料1. 试剂：- 脲酶试剂：含有脲、水杨酸酚、氢氧化钠、硫酸铜等成分的溶液。

- 酸化试剂：含有硫酸的溶液。

- 标准氨溶液：已知浓度的氨溶液。

- 比色试剂：用于比色的溶液。

- 比色仪：用于测定吸光度的仪器。

2. 材料：- 试管：用于加样和反应的容器。

- 移液器：用于精确量取试剂的仪器。

- 磁力搅拌器：用于混合溶液的仪器。

四、操作步骤1. 标准曲线制备：- 准备一系列已知浓度的氨溶液。

- 将氨溶液加入试管中，每组加入2ml。

- 加入等体积的酸化试剂，混匀。

- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用比色仪测定吸光度，以氨浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 脲酶活性测定：- 准备待测样品，按需稀释。

- 将样品加入试管中，每组加入2ml。

- 加入等体积的酸化试剂，混匀。

- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用比色仪测定吸光度。

- 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。

五、注意事项1. 试剂应保存在阴凉、干燥、避光处，避免与有机溶剂接触。

2. 操作过程中应避免样品污染，确保实验结果的准确性。

3. 试剂加入顺序应严格按照操作规程进行，避免产生误差。

4. 实验过程中，严格控制反应时间，确保反应完全。

5. 使用比色仪时，注意校准仪器，确保测量结果的准确性。

六、结果记录与分析1. 记录每组实验的吸光度值。

2. 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。

3. 对实验结果进行统计分析，判断脲酶活性是否符合预期。

七、质量控制1. 定期进行空白试验，以排除试剂和操作过程中的干扰。

2. 使用已知脲酶活性的标准样品，对实验结果进行校准。

3. 定期对仪器进行维护和校准，确保实验结果的准确性。

靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性一、实验原理靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+－N含量呈正比，线性范围为0。

05～0.5mg/l之间.靛酚蓝反应原理如下：NH3 + OCl-—NH2 Cl +OH-三、实验试剂1） 10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml。

2) 柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升.3）苯酚钠溶液(1.35mol/L)：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18。

5毫升丙酮,用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中;27克NaOH溶于100毫升水（B）。

将AB 溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

4）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

（9ml—100ml中) 5）氮的标准溶液(0。

1mg/ml)：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml含有0。

1mg氮的标准液。

6）甲苯四、实验过程1.标准曲线的测定吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml，摇匀。

从其中分别吸取0，1.00,3.00，5。

00,7.00，10。

00ml 13。

00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠的溶液，充分混合。

紧接着加入3ml次氯酸钠，随加随摇匀，放置20分钟，用水稀释至刻度。

将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以1cm比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。

以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

2。

土样中脲酶活性的测定分别称取2g过1mm筛的风干土样于50ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土样全部湿润为宜。

放置15分钟后，加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（pH=6。