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申请代码H1606受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学基金申请书(2010版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?申请人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：266021 单位电话：电子邮箱：申报日期： 2010年2月26日国家自然科学基金委员会经费申请表（金额单位：万元）报告正文一、立项依据与研究内容：（一）项目的立项依据原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。
肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。
了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]。
E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。
E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。
E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功能[3]。
E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[ 4-5 ]。
有人认为提高E-cadherin的表达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]。
与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]。
有人报道缺乏E-cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。
E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。
目前认为可能是由于基因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。
报告正文（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据XXX疾病及其研究进展XXXX疾病（XXXXXX，XXX英文名称）是XXX系统(消化、呼吸、神经等等)常见的一种疾病类型，多数是由于XXXX出现功能紊乱以及XXXX功能失调等所诱发，主要表现为XXXX（临床症状或者临床特征），致使XXX组织或者器官发生XXXX等症状，可以引起XXXX、XXXX以及XXXX等严重后果。
同时，XXXX（该疾病）也是导致其他类XXXX 相关疾病的主要原因之一。
目前的研究表明，XXX疾病主要是由于XXXX所引起的（或者说跟XXX有关，也可以说关于该疾病的发病机制还没有研究清楚），对于该疾病的治疗，目前尚没有有效的治疗方法或者药物（或者目前已有药物有哪些不足，存在哪些问题）。
近年来，随着xxxx的改变，我国XXX疾病的发病率呈现逐年上升且年轻化的趋势。
大量的基础和临床研究表明，导致XXX疾病的危险因素主要包括：XXXXXX等。
其中XXX 的失调/XXX功能紊乱/XXXX异常等是引起该疾病的主要原因所在。
所以，调节XXXX方面的功能是目前治疗和预防XXXX疾病发生和发展的主要关注途径。
如针对XXX疾病主要动因的药物羟XXXX、XXXX以及XXXX等已经逐渐成为该疾病的主要药物。
但是该类药物目前存在XXXX方面的缺点（成本高、副作用大等等），所以开发新的治疗该类疾病的靶向药物显得至关重要。
注：该部分主要内容是提出临床问题，可以是某一个疾病、或者某一个疾病过程中的一个问题等等，所以该段最好按照以下顺序来写：1、临床现象某某疾病是怎么回事（疾病简介），或者在某疾病的治疗或者发生、发展过程中观察到的某个临床现象。
2、该临床现象的症状、危害及严重性主要描述该临床现象（一般是某种疾病）的临床症状、严重程度、危害性或严重性等。
3、提出临床问题即在目前某种临床现象（疾病）存在哪些不足或者未解决的问题急需解决。
XXXX分子及其介导的信号通路在XXX疾病中的作用已有的研究的发现，XXXXX分子及其所介导的XXX信号通路在XXX疾病发生和发展的过程中发挥着非常关键的作用。
国家自然科学基金标书写作全攻略+成功范例1份指导思想篇1、追求卓越，在知识上要绝对专业，坚决反对侥幸心理。
2、相信NSFC申请是公平的，大家靠实力竞争，必须花大力气写标书；如果你认为NSFC 只有关系，你就不用继续往下看了。
3、NSFC是一个系统工程，需要花很多时间和精力，而不仅仅是几页标书，是智慧沉淀的结晶。
4、不要把NSFC看的高不可及，你要相信自己的创意，哪怕你只是一名一年级硕士5、机会主义是有的，但我们没有什麽其它的资本，只能消灭标书里一切可能的失败因素，加上完美的选题和课题设计，彻底征服评委，不给评委任何黑掉你的机会。
6、基金申请不同于实际研究课题设计，必须把个人兴趣与NSFC兴趣结合一致，投其所好。
选题立项篇1、基金成败关键还是选题要好，提前半年，刚入行的提前一年进行课题搜索2、老板指定的题未必是好题，最好自己选题，如何立项应该是研究生学习最重要的一课，毕业后你会发现，没有人会指点你什麽课题有价值了，在中国学术的沙漠里，只剩下你自己了。
3、好课题是对学科深刻理解的条件下产生的，大量翻阅文献吧，汲取知识的同时千万别忘了思考，你发现别人存在漏洞的时候，好课题就离你不远了。
4、选题最好以问题为导向，不要以技术为导向，找到问题了，课题就找到了。
而拿着新技术去找能解决的问题，效果多数不好，但还是大有人在，比如RNAi。
5、解放思想，发散思维，多方法多学科交叉，一般都会比较受人青睐，容易申请到基金，但不能为了交叉而强行交叉。
6、创新性新技术、新理论的课题要有一定的理论与技术基础，最好有工作基础，没有你也要东拼西凑，这是在中国，NSFC似乎讨厌空中楼阁7、临床课题研究最好别选临床应用方向，而选应用基础研究。
8、选择自己熟悉，有工作基础的领域，别跨越太远。
你是在谝钱，记住了，你不装的象个行家，NSFC是不会给钱的。
9、重要科学问题的切入点准确，切忌过宽、过大，只要体现一定的新意和研究价值就行了，能得诺贝尔奖的课题NSFC是不给钱的。
手把手教你撰写国自然标书解螺旋公众号·陪伴你科研的第2484天一些最后的重点提示国自然全称国家自然科学基金，从事医学研究的老师想要晋职称、发文章，或多或少都离不开国自然的帮助和依托。
当然了，国自然的申请也可谓是充满难度，尤其对于年轻老师来说，其10%左右的中标概率确实是可遇而不可求啊!想要顺利拿下国自然，人脉和科研团队是一方面，如何写一本亮眼的标书，才是真正考验各位真才实学的时候。
那么，撰写国自然标书有什么规律和套路可循么?接下来，小编带你揭开撰写国自然标书的神秘面纱！1国自然的前世今生据统计，2020年面上、青年项目的资助率整体下滑近10%，而医学部面上项目资助率从15.99%降到13.61%，下降幅度接近15%；地区科学基金平均降幅不大，但医学部地区科学基金资助率下降近14%，因此，广大青年科研人员关心的几类基金资助率相比2019年大幅下滑！2020年国自然评审与以往的另一区别是标书总体质量显著提高，无论是从写作水平、申请人发文数量还是前期实验的完成情况等方面，相比于2019年均显著提升，这与近几年大家对国自然的重视程度与晋职压力密不可分，想要成功上岸，的确任重而道远！2评审程序国自然的评审过程比较复杂，投标人在规定的日子提交标书后，首先要经过评审会初筛，以筛选掉格式、伦理、或者主题不符的标书。
随后，标书将进入到由3-7名同行函评专家进行评议阶段，评审专家提交给基金委的最终评审结果一般分为A、B、C三个等级。
当多数专家同意资助时，可被纳为建议资助或候补资助候选人，评选重点项目和优青/杰青的候选人在6-7月份时还要进行答辩，最后由专家评审组进行最终评审，并在8月份左右公示中标名单！3形式审查申请书的书写实际上是一个“内行看问题，外行看形式”的过程，标书的内容一定要格式规范、层次具体和语言可读。
标书提交进入到初筛程序时，首先会进行形式审查，一般在该流程会毙掉1-2%的不合理标书，最多时也曾达到过6.5%！可见，形式审查内容的重要性不容小觑。
国自然基金标书模板一、研究背景。
国自然基金是我国用于支持基础研究的重要渠道，旨在推动科学技术的发展，提高科技创新能力。
本项目旨在申请国自然基金，以支持我们团队在某一特定领域的研究。
二、研究意义。
我们团队的研究将填补当前领域的空白，解决某一具体问题，对于推动相关领域的发展具有重要意义。
通过本项目的研究，我们将为相关领域的发展提供新的理论支撑和实践指导。
三、研究内容。
本项目将围绕某一具体问题展开研究，主要包括理论分析、实验设计、数据采集和分析等内容。
通过系统的研究方法和科学的数据分析，我们将得出一系列重要结论，并形成相关成果。
四、研究目标。
本项目的研究目标是明确的，我们将通过系统的研究，解决某一具体问题，提出新的理论观点，并为相关领域的发展做出贡献。
同时，我们也将培养一批相关领域的研究人才，为我国科技发展做出贡献。
五、研究方法。
本项目将采用某一具体的研究方法，包括实验研究、调查研究、数学模型等。
我们将结合实际情况，选择最合适的研究方法，以确保研究的科学性和可靠性。
六、研究进度安排。
我们将严格按照项目计划，按时完成各项研究任务。
通过科学的进度安排和严格的执行，确保项目的顺利进行和取得预期成果。
七、预期成果。
我们预期通过本项目的研究，取得某一具体问题的重要研究成果，发表高水平的学术论文，取得专利和软件著作权等成果。
同时，我们也将在相关领域的学术会议上进行交流，推动研究成果的转化和应用。
八、研究团队。
我们的研究团队由一批具有丰富研究经验和扎实理论基础的专家学者组成，具有较强的研究能力和团队协作能力。
我们将充分发挥团队优势，确保项目的顺利进行和取得预期成果。
九、经费预算。
我们对项目所需经费进行了详细的预算，确保经费的合理使用和科学管理。
我们将按照国自然基金的相关规定，严格执行经费管理制度，确保经费的使用合法、合规。
十、风险与对策。
我们充分考虑了项目实施过程中可能出现的各种风险，并制定了相应的对策。
我们将采取有效措施，降低项目实施中的各种风险，确保项目的顺利进行和取得预期成果。
申请代码H1606受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学基金申请书(2010版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?申请人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：266021 单位电话：电子邮箱：申报日期： 2010年2月26日国家自然科学基金委员会经费申请表（金额单位：万元）报告正文一、立项依据与研究内容：（一）项目的立项依据原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。
肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。
了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]。
E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。
E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。
E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功能[3]。
E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[ 4-5 ]。
有人认为提高E-cadherin的表达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]。
与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]。
有人报道缺乏E-cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。
E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。
目前认为可能是由于基因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。
申请代码H1606受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学基金申请书(2010版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?申请人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：266021 单位电话：电子邮箱：申报日期： 2010年2月26日国家自然科学基金委员会基本信息yoKWT/OQ申请人信息姓名性别男出生年月1973年4月民族汉族学位博士职称副主任医师每年工作时间（月） 8 电话电子邮箱传真国别或地区中国个人通讯地址工作单位主要研究领域肿瘤分子生物学依托单位信息名称联系人电子邮箱电话网站地址合作研究单位信息单位名称复旦大学[在此录入修改］项目基本信息项目名称Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化Ｅ-cadherin?资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码H1606:肿瘤复发与转移H1617:消化系统肿瘤基地类别研究年限2011年1月— 2013年12月研究属性基础研究申请经费35.0000万元摘要(限400字)：E-cadherin的丧失与肝癌转移密切相关。
其丧失的主要原因是由于其酪氨酸残基被磷酸化后蛋白被降解。
我们通过酵母双杂交发现一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。
Pyk2活性增强可促进肝癌细胞迁移。
本课题假设Pyk2结合并磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加。
本课题设计首先通过GST pulldown、免疫共沉淀证明二者相互作用可靠；其次通过磷酸化实验确证Pyk2可以磷酸化E-cadherin；然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分析在人肝癌标本中二者表达的相关性以及与转移的关系。
本课题新发现Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促进肝癌细胞迁移和肿瘤转移，具有国际先进性。
国家自然科学基金完整的标书范文20**年国家自然科学基金面上项目题目：研究真核起始因子X-Y轴调控糖基转移酶对肠癌肝转移的作用机制摘要：大肠癌手术后复发转移中，肝、肺转移是最常见的转移模式，但其机制一直未能阐明。
在前期研究中，我们建立了大肠癌远处转移的特征分子谱式，发现真核起始因子Z家族的成员X和Y在肝转移中具有关键调节作用。
X-Y轴能够介导大肠癌肝转移的发生，X可促进细胞获得运动能力，并在转移灶中通过Y的相互作用促进细胞异常增殖。
进一步实验表明，X 能调节下游糖基转移酶，可能激活肠癌细胞膜表面半乳糖残基，从而通过与肝细胞膜上特异性受体相互作用而使肠癌细胞“定居”于肝脏。
可见，X-Y调节轴对于大肠癌肝转移至关重要。
本项目拟在此基础上，从大样本回顾性分析中总结X-Y对于结肠癌肝转移的临床相关性和预后判断价值。
同时，在细胞和动物模型中进一步深入探讨其在结肠癌肝转移调控中的作用方式和调控分子机制，解析下游效应途径及靶点。
一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：一、立项依据大肠癌是一种发生在结肠或直肠中的癌症，是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病人约八百万，占所有恶性肿瘤的10%-15%，其发病率和死亡率居恶性肿瘤的第三位。
随着手术、化疗、放疗水平的提高，大肠癌患者的生存率有了较大的提高，但远处转移是影响其预后的最主要因素。
在美国大肠癌中有90%的死亡由肿瘤的远处转移所致。
因此，通过研究大肠癌转移机制，正确认识大肠癌术后转移模式，制定合理的术后随访方案，采取有针对性的干预措施，提高生存率至关重要。
我们的研究关注于肝转移中的特异分子标志，其中两个成员属于真核起始因子Z家族：X和Y。
Z真核起始因子在真核生物翻译起始过程中起着重要作用，但其在肿瘤中的作用尚不清楚。
我们发现Y基因在大肠癌细胞中高表达，其表达被干扰后，细胞增殖能力显著抑制，细胞凋亡比例提高。
考虑到X与Y之间存在相互结合，我们进一步观察了两者之间的交互作用。
20**年国家自然科学基金面上项目示例版题目：真核起始因子X-Y轴调控糖基转移酶对肠癌肝转移的作用机制摘要：大肠癌术后复发转移中，肝、肺转移是最常见的转移模式，对其机制一直未能阐明。
申请者在前期工作中建立了大肠癌远处转移的特征分子谱式，在肝转移相关分子标志中，发现真核起始因子Z家族的成员：X和Y具有关键调节作用。
X-Y 轴能够介导大肠癌肝转移的发生，X可促进细胞获得运动能力，并且在转移灶中通过Y的相互作用促进细胞异常增殖。
进一步实验证实，X能调节下游糖基转移酶，可能存在激活肠癌细胞膜表面半乳糖残基，从而通过与肝细胞膜上特异性受体相互作用而使肠癌细胞“定居”于肝脏的机制，可见X-Y调节轴对于大肠癌肝转移至关重要。
本项目拟在此基础上，从大样本回顾性分析中总结X-Y对于结肠癌肝转移的临床相关性和预后判断价值。
同时，在细胞和动物模型中进一步深入探讨其在结肠癌肝转移调控中的作用方式和调控分子机制，解析下游效应途径及靶点。
（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：一、立项依据大肠癌是一种发生在结肠或者直肠中的癌症，是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病人约八百万，占所有恶性肿瘤的10%-15%，其发病率和死亡率居恶性肿瘤的第三位[1]。
随着手术、化疗、放疗水平的提高，大肠癌患者的生存率有了较大的提高，但远处转移是影响其预后的最主要因素。
在美国大肠癌中有90%的死亡由肿瘤的远处转移所致[2]。
所以，通过对大肠癌转移机制的研究，正确认识大肠癌术后转移模式，对于制定合理的术后随访方案，采取有针对性的干预措施，提高生存率至关重要。
大肠癌最常见的远处转移部位是肝脏和肺。
对于肝转移，人们更多的把原因归结为解剖因素，结肠是通过门静脉系统回流进入肝脏，所以认为大肠癌的首发转移部位往往在肝脏。
但是很多临床研究发现大肠癌患者术后转移可以绕开肝脏而首先出现在肺部甚至是甲状腺转移[3-6]，有报道出现首发肺转移的大肠癌患者最高可达患者总数的6%，已经相当可观[7]，这就对我们的随访策略提出挑战，对于大肠癌患者即使术后没有肝转移，也不能放松对肺部的检查。
浙江省自然科学基金申请书浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息本文档如对你有帮助，请帮忙下载支持！项目组主要成员2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。
个人介绍：申请经费预算8.0 万元号）。
申请者承诺：我保证：（1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。
若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。
签字：日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。
申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。
依托单位公章日期.促红细胞生成素受体在心肌缺血再灌注过程中的表达及功能1、项目研究意义随着溶栓和急诊介入治疗的广泛开展，心肌梗死患者短期和长期的生存率得到显著提高，但仍有相当部分存活的患者随后发生进行性心力衰竭。
缺血/再灌注导致的心肌损伤是目前心机梗死治疗中有待解决的关键问题，有文献报道，心肌缺血/再灌注过程中凋亡的发生是导致心肌损伤的重要机制之一[1]。
凋亡是细胞程序性死亡，因此，可以通过早期干预减少凋亡的发生，从而降低心肌在缺血复灌过程中的损伤[2]。
在动物实验中已经证实，应用抗凋亡药物，细胞因子或采用基因治疗可减轻心肌缺血/再灌注损伤。
但目前某些抗凋亡方法尚不能应用于临床，而已有抗心肌再灌注损伤的临床试验未见显著的心肌保护作用[1]。
申请代码H1606受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学基金申请书(2010版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?申请人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：266021 单位电话：电子邮箱：申报日期： 2010年2月26日国家自然科学基金委员会基本信息yoKWT/OQ申请人信息姓名性别男出生年月1973年4月民族汉族学位博士职称副主任医师每年工作时间（月） 8 电话电子邮箱传真国别或地区中国个人通讯地址工作单位主要研究领域肿瘤分子生物学依托单位信息名称联系人电子邮箱电话网站地址合作研究单位信息单位名称复旦大学[在此录入修改］项目基本信息项目名称Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化Ｅ-cadherin?资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码H1606:肿瘤复发与转移H1617:消化系统肿瘤基地类别研究年限2011年1月— 2013年12月研究属性基础研究申请经费35.0000万元摘要(限400字)：E-cadherin的丧失与肝癌转移密切相关。
其丧失的主要原因是由于其酪氨酸残基被磷酸化后蛋白被降解。
我们通过酵母双杂交发现一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。
Pyk2活性增强可促进肝癌细胞迁移。
本课题假设Pyk2结合并磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加。
本课题设计首先通过GST pulldown、免疫共沉淀证明二者相互作用可靠；其次通过磷酸化实验确证Pyk2可以磷酸化E-cadherin；然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分析在人肝癌标本中二者表达的相关性以及与转移的关系。
本课题新发现Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促进肝癌细胞迁移和肿瘤转移，具有国际先进性。
这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解，对于药物研发提供新的思路。
关键词(用分号分开，最多5个)肝癌；E-cadherin；Pyk2；肿瘤转移经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费28.75001.科研业务费7.6000（1）测试/计算/分析费 2.1000 DNA测序，生物信息分析，统计分析（2）能源/动力费（3）会议费/差旅费 1.0000 参加学术会议3-4人次（4）出版物/文献/信息传播费 3.0000 文献检索，发表论文，专利申请（5）其他 1.5000 成果鉴定2.实验材料费21.1500（1）原材料/试剂/药品购置费17.1500 各种试剂盒，脂质体，抗体，细胞培养，实验耗材（2）其他 4.0000 动物饲养，临床调研3.仪器设备费0.0000（1）购置（2）试制4.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费 1.50001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流 1.5000 邀请美国康奈尔大学关军林教授合作交流三.劳务费 3.0000研究生加班补贴四.管理费 1.75005%管理费合计35.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000查看报告正文撰写提纲报告正文一、立项依据与研究内容：（一）项目的立项依据原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。
肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。
了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]。
E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。
E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。
E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功能[3]。
E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[ 4-5 ]。
有人认为提高E-cadherin的表达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]。
与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]。
有人报道缺乏E-cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。
E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。
目前认为可能是由于基因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。
但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见[12-13]。
因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。
有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin能够与Hakai（一种E3泛素连接酶）结合，使其泛素化而降解[14 ]。
那么有多少酪氨酸激酶参与这个机制呢？有报道EGFR，IGF-1R能够磷酸化E-cadherin。
对于E-cadherin磷酸化的调节机制目前仍然不是非常明确。
为了解E-cadherin在肝癌细胞的分子信号通路，我们以E-cadherin（胞内段）为诱饵应用酵母双杂交（CytoTRAP系统）在肝脏的cDNA文库中筛选到一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶-Pyk2。
那么，Pyk2是否能磷酸化E-cadherin 并调节细胞迁移呢？Pyk2(proline rich tyrosine kinase 2)是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋白激酶，与FAK同源度较高，属于FAK家族。
Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在调节细胞存活、增殖和迁移[16]方面受到越来越多的关注。
Pyk2信号通路的活化能够增强细胞运动和迁移，研究发现Pyk2在多种肿瘤的侵袭和转移中起作用[17-18]。
其中Sun等研究表明， Pyk2在59%的肝癌组织中表达上调， Pyk2高表达与肝癌组织体积、Edmonson分级呈正相关， Pyk2表达越高病人预后越差。
动物实验显示在侵袭边缘的肝癌细胞和转移到肺结节中的肝癌细胞均发现Pyk2高表达。
肝癌细胞株转染Pyk2后，其迁移功能增强；而用裸鼠做实验发现抑制Pyk2的活性后肝癌肿瘤的大小和肺转移率都较对照明显减少[19-20]。
Pyk2调节肿瘤转移的具体机制是什么呢？有研究表明，在肝癌细胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，与c-Src形成复合体激活ERK通路，从而增强肝癌细胞的侵袭性[19-20]；也有报道Pyk2与 PECAM-1（血小板/内皮细胞粘附分子，与E-cadherin一样都属于钙粘附蛋白家族）结合并且都影响肿瘤细胞的侵袭性[21]；还有报道RhoC通过激活Pyk2促进前列腺癌转移[18]以及与SOCS3、Cyr61有关等 [22-23]。
总而言之，目前Pyk2调节肿瘤细胞转移的具体机制仍不十分清楚。
Pyk2与E-cadherin能否结合并调节肝癌细胞的侵袭转移呢？这是我们想要研究的问题。
我们继续应用酵母双杂交反复验证、GST-Pulldown实验、免疫共沉淀证明二者相互作用是可靠的（具体结果见研究基础）。
那么，现在的问题是二者在体内状态下是否结合？结合后的调节机制是什么？二者的结合位点在什么地方？结合后如何调节细胞迁移以及影响肿瘤转移？考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，我们的前期工作发现E-cadherin与Pyk2的激酶部分结合，因此有两种可能性。
一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种就是E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。
我们认为第一种可能性较大。
有文献报道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族成员）并且抑制其与Catenin，P120等形成复合体[24-25]。
E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该也有可能磷酸化E-cadherin。
因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。
但是也不能排除第二种可能性，E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性，从而导致肿瘤细胞侵袭性下降。
申请人以前的工作就发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ- Protocadherins能够抑制Pyk2的活性[26]，申请人做这方面工作时曾取E-cadherin做对比参照，结果发现抑制Pyk2激酶活性不是很明显（本数据未发表），因此不支持第二种可能性。
二者具体如何调节还需要进一步实验来证实。
本课题的设计主要是为了解答上述问题。
首先在前期工作基础上继续明确Pyk2与E-cadherin能相互作用以及调节机制；其次应用细胞迁移实验确定二者的调节对肿瘤细胞迁移、侵袭性的影响；然后应用裸鼠成瘤转移实验明确二者的调节在对肝癌远处转移的影响；最后分析在肝癌病人组织标本中二者表达的相关性以及与转移的相关性。
本课题在国际上最新发现Pyk2与E-cadherin直接相互作用，并且确定其结合机制，明确这种调节与肝癌细胞迁移力和肿瘤转移的关系。
这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解。
许多新型抗癌药物如赫赛汀、格列卫、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶为治疗靶点，取得非常好的疗效。
本研究对于确定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做为分子治疗靶点、设计合理的治疗药物可以提供更有利的素材。
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