叶绿素理化性质的测定

取鲜叶3-5g+95%乙醇15-25ml（逐步加入）,磨成匀浆

过滤入三角瓶中
观察荧光现象 透射光 色，反射 光 光。
定性实验 无需移液管量 皂化反应(约1ml)
加KOH数片剧烈摇均， 加石油醚1ml和H2O 1ml 分层后观察 上层呈 吸收 下层呈 吸收 色，为 光。 色,为 光。 ， ,
取代反应（约1mL）
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝 卜素和叶绿素的吸收峰
• 3．叶绿素定量分析：
称取鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份 0.2ml 分别加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心 5min, 上清液在 649 ， 652 ， 665 测定 OD ，计算 Chla,Chlb 和Chl总量的值。
5、定量分析：叶绿素吸收红光和兰紫光，红
光区可用于定量分析，其中665 和649用于定量 叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量测定
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 400 500 Waverlength(nm) 600 700
a
b
• 实验步骤 1．定性分析：
加醋酸约1ml，变褐 为_________叶绿素 , 取1/2加醋酸铜粉,加热变 色，为 叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝ຫໍສະໝຸດ 素的吸收光谱测定：皂化反应的上层 黄色石油醚溶液 弃上层，反复用石油醚萃取,直 到无类胡萝卜素, 得叶绿素(盐)
（稀释470nm OD 0.5-1） （稀释，665nm OD 0.5-1）
• 五、实验数据记录和处理
• Ca(mg/L)=13.95A665-6.88 A649 • Cb (mg/L) =24.96A649-7.32 A665 • CT (mg/L) = Ca+ Cb 或A6521000/34.5

实验一叶绿体色素的分离及理化性质测定实验目的：1.了解叶绿体的组成及结构特点；2.掌握分离叶绿体的实验方法；3.测定叶绿体色素的吸收光谱，了解叶绿体色素的化学结构；4.学习色素溶液的制备及测定吸收光谱的方法。

实验原理：叶绿体是植物细胞中的一种特殊细胞器，它的主要功能是光合作用，能够吸收光能并将其转化为有机物质。

叶绿体中含有一系列的叶绿素和其他色素，这些色素的共同作用是吸收不同波长的光能，并将其转化为化学能。

为了分离叶绿体的色素，我们需要将植物细胞破碎，并利用离心力将叶绿体分离出来。

离心力的大小决定了离心上清液中所包含的叶绿体数量，因此，离心参数的选择非常重要。

得到叶绿体后，我们可以使用乙醇或其他溶剂将其色素提取出来。

叶绿素a是叶绿体中最主要的色素，其化学结构为卟啉结构，含有一个镁原子。

叶绿体中还含有其他种类的叶绿素和类胡萝卜素等色素，它们的化学结构虽然不同，但都具有吸收光谱。

实验步骤：1.取适量新鲜菠菜叶子，用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗干净，去除表面的灰尘和其他杂质。

将菠菜叶子放入离心管中，加入等体积的砂糖缓冲液，用玻璃棒捣碎成细胞浆状，避免破坏叶绿体。

将离心管置于离心机中，先进行低速离心（2000g）10min，离心后得到上清液，然后进行高速离心（10000g）15min，此时在离心管中可见下沉的绿色沉淀。

用吸管小心地将上清液吸走，然后将叶绿体沉淀用1ml冷洗涤液溶解。

2.将叶绿体溶液转移到玻璃细胞中，在可见分光光度计上分别测定叶绿体吸收光谱。

用叶绿体洗涤液作为空白对照。

记录各波长下吸光度值，绘制出叶绿体色素的吸收光谱曲线。

3.将等量的叶绿素a和β-胡萝卜素分别溶解于乙醇中，测定它们的吸收光谱，并绘制出吸收光谱曲线。

将这些谱线与叶绿体谱线进行比较，确定叶绿体中含有的其他色素种类。

实验结果：叶绿体色素的吸收光谱曲线如下图所示，其中叶绿素a的吸收峰位于675nm和450nm 处，其它叶绿色素和类胡萝卜素的吸收峰位于不同波长处。

CT = Ca + Cb = 20.2D645 + 8.02D663 注意：在此式中叶绿素浓度单位为 mg/L 。
叶绿素a、b在 652 nm 处有相同的比吸收系数 （34.5）,也可在此波长下测定一次光密度D652， 求出叶绿素a、b的总量。
D652X 1000 CT = 34.5
实验步骤
1. 提取: 称0.5 g菠菜叶片，剪碎置研钵中, 加少量碳酸 钙和石英砂,加入80% 2-3mL于研钵中, 研成匀浆,再加 入2-3 mL 80%丙酮，研磨充分，用丙酮湿润的滤纸过 滤(在漏斗上完成，注意石英砂尽量不要倒入漏斗中， 以免堵塞滤纸,影响过滤)，并用少量丙酮将滤纸和研钵 冲洗干净，定容至25 mL试管中。 2. 稀释: 取5ml提取液于另一刻度试管中，加5 mL 80% 丙酮稀释（可根据具体情况调整稀释倍数，使OD值在 0.2-0.8范围内）。
四 思考题:
1．叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸 收峰波长进行叶绿素a、b进行定量分析？为什么？
苯倒入废液瓶中！
四 吸收光谱的观察
叶绿素吸收红光和兰紫光； 类胡萝卜素吸收兰紫光；
类胡萝卜素的吸收光谱
叶绿素的吸收光谱
画图并说明原因
五 氢和铜代叶绿素反应
叶绿素在弱 酸作用下，叶绿 素中镁可被H+取 代而成为褐色的 去镁叶绿素，后 者遇铜则成为绿 色的铜代叶绿素。
取叶绿体色素5ml，加浓 盐酸1滴摇匀，观察溶液 颜色的变化。
当溶液变褐色后，取 一半去镁叶绿素提取液， 投入少许醋酸铜粉末， 微微加热，观察溶液颜 色的变化。
不要盖试管盖！
色素提取
方法与步骤
荧光 皂化

代替
吸收
叶绿素的定量测定

植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。

研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。

本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。

材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。

方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。

2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。

3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。

4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。

5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。

6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。

7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。

结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。

加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。

加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。

通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。

叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。

这种反应也证实了叶绿体的存在。

叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。

叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。

乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。

这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。

实验3叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定实验三叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定【实验原理】叶绿体⾊素⼜称光合⾊素，在⾼等植物中可分为叶绿素和类胡萝⼘素两⼤类，前者包括叶绿素a（蓝绿⾊）和叶绿素b（黄绿⾊），后们类囊体膜上的蛋者包括胡萝⼘素（橙⾊）和叶黄素（黄⾊），它与⽩质结合形成⾊素蛋⽩复合体，不溶于⽔，易溶于酯，因此可⽤丙酮、⼄醇、⽯油醚等有机溶剂进⾏提取。

叶绿体⾊素的分离有多种⽅法，本实验仅介绍纸层析法。

层析的基本原理：在分离过程中，由⼀种流动相（即⼀种液体或⽓体）带动着试样经过固定相（⼀种⽀持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当⽤适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过⼀定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合⾊素中各种⾊素分⼦的吸附程度不同，以及这些⾊素分⼦在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动⾊素分⼦向四周移动时，各种⾊素分⼦沿纸扩散的速度也就不同，使混合⾊素分离，出现不同颜⾊的环。

将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿⾊，在反射光下呈这现象称为荧光现象。

在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红⾊，种发态，激发态的叶樱桃红⾊，是因为叶绿⾊分⼦吸收光能后处于激状绿素分⼦很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量⼦。

叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、⾼温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋⽩质分离以后，破坏更快，⽽类胡萝⼘素则较稳定。

叶绿素中的镁可以被H＋所取代⽽成褐⾊的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）⼜被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐⾊转变成蓝绿⾊，铜代叶绿素很稳定，且⽐原来的绿⾊还要稳定些，在光下也不易被破坏。

设备试剂】【材料、与1. 材料新鲜的菠菜或⼩⽩菜等其他绿⾊植物叶⽚。

2. 设备电⼦天平、研钵、烧杯、量筒、培养⽫、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪⼑、圆形滤纸、⼩漏⽃等。

（脱镁叶绿素） ↓
↓ 分离色素
Cu取代 ↓
扫描光谱 花色素实验
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四. 结果与分析
对实验现象作好详细记录， 并加以解释 请对皂化反应现象做出合理解释，而不是
单单用反应方程式来表示
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五. 注意事项
实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要 远离火源。
研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研 磨时四处飞溅。
– B环上羟基和甲氧基数目 羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝 羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红
– 芳香酸对主要骨架的酯化 – 液泡中pH值 酸红碱蓝 – 营养状况 低温、缺氮、缺磷 促进化色素的形成和积累
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不同花色素的取代基和颜色
花色素
3’
4’
花葵素
-H
-OH
花青素
-OH -OH
根据三碳桥的氧化程度可分为：
花色素苷：呈现颜色。紫色锌化物、红色的碱盐、无色化合物
黄酮
防御伤害。 存在于花器官和绿叶中。
黄酮醇 紫外光保护剂，吸收UV-B，避免细胞受到伤害。
异黄酮
功能多样。鱼藤酮杀虫，植物防御素抑制微生物。
13
花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。 颜色受多因素影响：
6.3 如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类 胡萝卜素还是花色素？
20
（2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射
光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒） 磷光： Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内
放出暗红色的光。 寿命长（10-2秒——10-3秒）
5
6
7
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பைடு நூலகம் 1.2 类胡萝卜素

实验一叶绿体色素 的分离及理化性质 测定
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验总结与展望
01
CATALOGUE
实验目的
掌握叶绿体色素的分离方法
叶绿体色素的提取
通过使用有机溶剂（如丙酮、乙醇等 ）从植物组织中提取叶绿体色素。
叶绿体色素的分离
采用色谱法（如薄层色谱、高效液相 色谱等）将叶绿体色素中的不同组分 进行分离。
研磨与过滤
将叶片放入研钵中，加入 适量的石英砂和无水乙醇 ，研磨至匀浆。通过纱布 过滤，收集滤液。
离心分离
将滤液倒入离心管中，用 离心机离心，分离叶绿体 色素。
叶绿体色素的分离
制备滤纸条
将滤纸剪成长约5cm，宽约1cm的纸条，标明起点。
点样与展开
用毛细管将色素提取液点在滤纸条的起点线上，然后将其放入展开 剂中（如石油醚、乙醚、丙酮等）进行展开。
色素组成
02
实验结果显示，叶绿体色素主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜
素和叶黄素组成。
含量变化
03
实验中观察到不同植物或同一植物不同部位叶绿体色素含量存
在差异。
叶绿体色素理化性质测定结果分析
溶解性
实验结果表明，叶绿体色素易溶 于有机溶剂，如丙酮、氯仿等， 难溶于水。
稳定性
在一定温度和光照条件下，叶绿 体色素稳定性较高，但在高温和 强光下易分解。
学习叶绿体色素的应用价值
生物指示剂
叶绿体色素可以作为生物指示剂，用于监测环境污染 和生态变化。
食品添加剂
叶绿体色素可用于食品加工中，如绿色饮料、果蔬汁 等，增加食品的色泽和营养价值。
生物燃料
叶绿体色素可以作为生物燃料的原料，通过微生物发 酵技术转化为生物燃料，如乙醇、生物柴油等。

叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定1 实验目的（1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法；（2）验证叶绿体素的理化性质。

2 实验原理2.1 叶绿素的提取叶绿体是进行光合作用的细胞器。

叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。

这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。

提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。

2.2 叶绿素的分离薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。

流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。

由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

2.3 叶绿素理化性质测定叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。

叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。

叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。

去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。

2.4 叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。

叶绿素的提取及理化性质的鉴定文件编码（008-TTIG-UTITD-GKBTT-PUUTI-WYTUI-8256）植物生理学实验叶绿体色素的提取分离及其理化性质姓名学号系别班级实验日期同组姓名摘要：为探究植物叶绿素理化性质，根据不同的叶绿体色素分子结构不同，在有机溶剂中的溶解性和吸附剂上的吸附性差异，本实验在提取菠菜叶片叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，利用纸层析法将不同的色素分离的方法，对植物叶绿素的理化性质进行观察与检验。

一、实验原理及实验目的实验原理：1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。

对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。

3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。

叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。

分子吸收光能后，从基态转变到激发态。

叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。

分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒）由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。

叶绿素a：C55H72O5N4Mg，MW=叶绿素b：C55H70O6N4Mg，MW=胡萝卜素：C40H56， MW=叶黄素：C40H56O2， MW=实验目的：以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质.二、实验材料和方法1、实验材料：菠菜2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试管等3、实验试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜三、实验步骤1、叶绿体色素的提取（1）取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;（2）加入少许石英砂和CaCO,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙3酮15ml;（3）用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处).2、纸层析分离叶绿体色素（1）层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约1cm×的窄条;（2）点样,用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部,用吹风机吹干后在原处重复点样7-8次;（3）展层,在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样的层析纸插入缸的侧壁槽内,调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中,盖好盖子,于阴暗处展层约10min,即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层;3、叶绿体理化性质的观察荧光现象的观察：取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色。

叶绿体色素的提取、分离及理化性质鉴定
实验目的了解叶绿素提取分离原理、方法，验证理化性质
实验原理叶绿素易溶于乙醇、丙酮，类胡萝卜素更易溶于苯；
叶绿素是双羧酸脂类，能与强碱发生皂化反应；
叶绿素分子中络合的镁能依次被H+、Cu2+取代；
叶绿素溶液光照后有荧光现象。

实验器材试管、研钵、太平、毛细滴管、剪刀、移液管、展层缸、滤纸、漏斗、50ml容量瓶、酒精灯、试管夹
实验试剂乙醇、丙酮、苯、盐酸氯化铜混和液、甲醇、氢氧化钾、石英砂
实验材料菠菜叶片
实验步骤
一、叶绿体色素的提取、分离
1、提取：叶片2g剪碎，放入研钵，加乙醇（或丙酮）5ml研磨匀浆，再加10ml，
过滤。

2、分离：滤纸一张，用毛细管在圆心处分次滴加提取液，圆心处穿孔，然后
插入滤纸圆芯；将其放入盛有展层液（汽油或丙酮：苯：石油醚＝9：1：
0.1混和液）的展层缸内，30min.后观察结果。

叶绿体色素被分离成从内
到外的篮绿（叶绿素a）、黄绿（叶绿素b）、浅黄（叶黄素）、橙黄（胡萝卜素）四个同心圆环。

二、叶绿素理化性质鉴定
1、荧光现象观察：浓提取液向光观察呈绿色，背光观察呈血红色（荧光）
2、皂化反应：加提取液0.5ml至试管，加入氢氧化钾的甲醇饱和液2ml，沿
管壁加水2ml，管内有乳白色沉淀出现（皂化）。

加苯1ml，静置5min，上层苯层呈深黄色（类胡萝卜素）。

3、取代反应：加提取液0.5ml至试管，加水2ml，加盐酸氯化铜混和液2ml，
用酒精灯慢慢加热，仔细观察溶液颜色依次有绿变褐（氢取代）再变篮绿（铜取代）。

实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。

原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。

2.皂化反应。

叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。

3.取代反应。

在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。

H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。

4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。

透射光下呈绿色，反射光下呈红色。

5.光谱分析。

叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。

三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。

b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。

加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。

2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。

观察颜色变化。

2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。

一、实验原理叶绿素是植物光合作用色素，主要有chla chlb ，不溶于水,可溶于酒精.丙酮和石油醚。

叶绿素是叶绿酸的酯，叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶醇酯化，能发生皂化反应。

叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇( 植醇，phytol) 的“尾巴”。

卟啉环中的镁原子可被H＋、Cu2 ＋、Zn2 ＋所置换。

用酸处理叶片，H＋易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。

去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。

人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。

叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，这种现象称为叶绿素荧光现象。

原因是当叶绿素分子吸收光量子后，就由最稳定的、能量的最低状态－基态（ground state）上升到不稳定的高能状态－激发态（excited state）。

叶绿素荧光指被激发的叶绿素分子从第一单线态回到基态所发射的光。

寿命很短。

处于第一三线态的叶绿素返回到基态所发射的光称为叶绿素磷光。

二、实验目的1．学会提取和分离叶绿体中色素的方法。

2．观察叶绿体中的各种色素。

3．掌握叶绿素的物理和化学性质三、实验用品1．材料与试剂：菠菜、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCL水溶液、醋酸铜结晶、KOH-甲醇溶液等。

2．仪器设备：载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、解剖刀、玻璃漏斗、分液漏斗中、研钵、试管、具塞锥形瓶等等。

四、方法和步骤1、叶绿体色素的提取• 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠或碳酸钙和10 mL丙酮，迅速研磨成匀浆，再加15 mL丙酮充分研磨提取叶绿素。

• 在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有15 mL石油醚的分液漏斗中，再用少量丙酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液。

• 沿分液漏斗的壁小心加入30mL蒸馏水，轻轻转动加入4 -8mL饱和NaCl水溶液，静止几分钟待分层清楚后，弃去下面的丙酮一水层。

低温下发生皂化反应旳叶绿体色素溶液，易乳化而出 现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。
2）取代反应
卟啉环中旳Mg处于不稳定旳状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。 稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg能够被H+所取代而成褐色旳去镁叶绿 素，去镁叶绿素遇Cu2+则成为深绿色旳铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定， 在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。
7. 思索题
1）用不含水旳有机溶剂提取植物材料尤其是干材料旳叶绿 体色素往往效果不佳，原因何在？
2）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？ 3）叶绿素a、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸
收峰波长进行叶绿素a、叶绿素b旳定量分析？为何？
加入少许碳酸钙旳目旳是为了预防在研磨过程中，叶绿素受到破坏。 详细旳情况是这么旳：叶绿体中旳色素所处旳环境具微碱性，试验中， 因为研磨会使细胞构造遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性旳 细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素旳分子构造遭到破坏， 使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液旳 酸性，可起到保护叶绿素旳作用 。
5. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+旳取代作用
1）吸收叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇 匀，观察溶液颜色旳变化。 （成果与分析4.1）
2）当溶液变褐色后，倾出二分之一于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉， 水浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同步加热）旳一管相比 较。（成果与分析4.2）
试验 叶绿体色素旳提取、理化性 质与含量测定
1. 试验目旳及意义
➢ 提取叶绿体色素 ➢ 分析叶绿素旳物理、化学性质 ➢ 测定叶绿素旳含量 ➢ 提取和测定植物组织中旳光合色素是研究光

实验4 叶绿素的理化性质一、实验目的：1、掌握叶绿体色素的提取、分离和含量的测定的方法。

2、掌握分光光度计的应用。

二、实验原理：理化性质：1.荧光现象：透射光下呈绿色，反射光下呈红色。

叶绿素吸收光量子→激发态→基态：发射出红光量子。

2.叶绿素分子的镁可被氢和铜替代镁→氢：褐色镁→铜：绿色3.皂化作用（绿色素与黄色素的分离）叶绿酸的酯+碱→醇+叶绿酸的盐三、实验用具及器材和药品：（1）天平、剪刀、研钵、烧杯、量筒、25ml容量瓶、滤纸、表面皿、漏斗、滴管、试管、酒精灯（2）石英砂、碳酸钙、80%丙酮、盐酸、醋酸铜晶体、乙醚、蒸馏水、30％KOH－甲醇溶液（3）菠菜叶四、实验步骤：1．叶绿素的提取：取菠菜（或其他植物）叶子2g，剪碎，放在研钵中，加石英砂和碳酸钙少许，80％丙酮约2-3ml，研磨成匀浆，再加80％丙酮定容至25ml，用漏斗过滤，即为色素提取液。

2. 叶绿素理化性质鉴定（1）叶绿素的荧光现象：观察在反射光和透射光下观察色素提取液的颜色有什么不同。

（2）氢和铜对叶绿素分子中镁的替代作用(稀释10倍后再做）取两支试管。

第一支试管加叶绿体色素提取液2毫升，作为对照。

第二支试管加叶绿体色素提取液2毫升，1滴1滴地加入盐酸，直至溶液出现橙色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。

然后加醋酸铜晶体1小粒，慢慢地在酒精灯上加热溶液，观察记录溶液颜色变化，并与对照试管比较。

（3）皂化作用（黄色素和绿色素的分离）将叶绿体色素提取液2毫升于试管中，加入4毫升乙醚，摇匀，沿试管壁慢慢加入5毫升左右的蒸馏水，轻轻混匀，静置片刻后，溶液即分为两层，色素已全部转入上层乙醚中。

用滴管吸取上层绿色层溶液，放入另一试管中。

在色素乙醚溶液中加入1－2毫升30％KOH－甲醇溶液，充分摇匀，静置。

溶液逐渐分为两层，下层是甲醇溶液皂化的叶绿素），上层是乙醚溶液（胡萝卜素和叶黄素）五、实验现象及结果：1. 叶绿素的荧光现象：在反射光下可以看到提取液呈黄绿色，在投射光下呈绿色。

叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告一、实验目的：1. 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。

2. 了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。

二、实验原理：叶绿体是进行光合作用的细胞器。

叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。

这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。

提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。

薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。

由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。

本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。

三、实验材料与试剂：1. 新鲜的菠菜叶片。

2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂〈石油醚：丙酮：苯=75：1，体积比>。

3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。

四、实验步骤：(一) 色素提取液的制备1. 取新鲜叶片4“5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。

2. 向研钵中加入少量CaCO₃**,再加2*3ml体积分数为 95%的乙醇,充分研磨至糊状，再加10°15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出。

残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。

提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验(如后面的叶绿素理化性质的验证)。

(二) 叶绿体色素的分离1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。