抗原分离纯化的基本操作方法

抗原的制备方法　除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。

由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。

一、抗原的提取 抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。

根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。

由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。

因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。

如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。

抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。

③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。

现分别简述如下。

（一）材料的选择及预处理 选择什么材料主要根据实验目的而定。

通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。

材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。

若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。

某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。

（二）细胞的粉碎 除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。

抗体纯化的方法有哪些抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。

常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDaIgG 150 50，25IgM 900 65，25IgM单体180 65，25硫酸铵沉淀法：基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。

适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA基本操作：1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清；2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白；3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐；4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含%叠氮钠）缓冲液洗脱；5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度；6.抗体保存浓度在mg/mL适宜，-20 ℃保存不超过一个月，避免反复冻融。

亲和层析法基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。

成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。

protein A的B结构域protein A的各个结构域protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。

基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。

抗原亲和纯化抗原亲和纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，其基本原理是利用抗体与抗原相互作用的特异性，将含有目标蛋白的混合物与相应抗体结合，然后通过洗涤、洗脱等步骤，最终得到纯净的目标蛋白。

本文将介绍抗原亲和纯化的基本原理、常见的实验步骤和注意事项。

一、基本原理抗原亲和纯化的基本原理是利用抗体与抗原之间的特异性结合，将含有目标蛋白的混合物与相应抗体结合，然后通过洗涤、洗脱等步骤，最终得到纯净的目标蛋白。

抗原亲和纯化的优点是选择性高、纯度好，适用于大多数生物大分子的分离和纯化。

二、常见的实验步骤1. 抗体制备：制备与目标蛋白特异性结合的抗体是抗原亲和纯化的关键。

抗体可以从动物血清或通过酶联免疫吸附法制备。

制备抗体时需要注意抗原的质量和纯度，以及抗体的选择性和亲和力。

2. 抗原结合：将含有目标蛋白的混合物与相应抗体结合。

可以通过直接结合或间接结合的方式进行抗原结合。

直接结合是将抗体直接固定在固相载体上，然后加入含有目标蛋白的混合物，目标蛋白与抗体结合。

间接结合是先将含有目标蛋白的混合物与抗体结合，然后将结合复合物固定在固相载体上。

3. 洗涤：将非特异性结合的成分洗掉，保留特异性结合的目标蛋白。

洗涤的条件需要根据抗体和目标蛋白的特性进行优化，一般采用高盐、低pH、有机溶剂等条件进行洗涤。

4. 洗脱：使用适当的溶液将目标蛋白从抗体上洗脱下来。

洗脱的条件需要根据抗体和目标蛋白的特性进行优化，一般采用酸性、碱性、高盐、有机溶剂等条件进行洗脱。

5. 确认纯度：通过SDS-PAGE、Western blot等方法确认纯度。

如果需要进一步提高纯度，可以通过离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等方法进行后续纯化。

三、注意事项1. 抗体的选择应根据目标蛋白的特性进行优化，包括亲和力、特异性、反应温度、抗原表位等因素。

2. 抗原的纯度和质量是影响抗原亲和纯化效果的关键因素，需要在抗原制备和纯化过程中进行严格控制。

抗原的分离与纯化技术介绍从细胞中提取出来的生物大分子是不纯净的，必须进一步分离纯化才能获得纯品。

在生物大分子制备工作中，分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。

对于异类的物质，如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸，提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖，一般可用专一性酶水解、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理，小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。

而对同类物质，如酶和杂蛋白，RNA和DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间的分离，情况则复杂得多，主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析法等。

其中盐析法、等电点法、结晶法用于蛋白、酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多；柱层析法、梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。

本节侧重对蛋白质、酶和核酸分离纯化中与溶解度有关的一些方法作一简要叙述。

1．蛋白质分离纯化的一些方法（1）盐析法①原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。

其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解度随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。

这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。

但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。

盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

②盐的选择：蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L;0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，不容易引起蛋白质变性。

抗原亲和纯化抗原亲和纯化是一项分离和纯化特定蛋白质的方法，该方法利用特定抗体与其相应的抗原结合，并将蛋白质从复杂的混合物中分离出来。

在分子生物学和生物化学领域中，抗原亲和纯化是常用的技术之一，可用于纯化单一蛋白、获得活性蛋白、制备抗体等。

本文将详细介绍抗原亲和纯化的基本原理、技术流程、优缺点及其应用。

一、基本原理抗原亲和纯化的基本原理是利用特定抗体与其相应的抗原结合。

抗原可以是任何分子，包括蛋白质、多肽、小分子化合物等。

抗体是一类高度特异性的蛋白质，它可以识别并结合与其特异抗原相结合的部位。

一般来说，为了进行抗原亲和纯化，需要在动物体内注射抗原，使其产生特异的抗体。

分离和纯化抗体后，将其与待分离蛋白质混合，待其结合后再使用某些方法将其分离出来，得到纯化的蛋白质。

二、技术流程1. 抗原注射：在动物体内注射待纯化蛋白质的抗原，使其产生特异的抗体。

2. 收集血清：收集动物体内产生的血清，含有特异的抗体。

3. 分离抗体：使用某种技术，如离心沉淀、蛋白A或蛋白G纯化、亲和层析等，将抗体从复杂的混合物中纯化出来。

4. 准备抗原柱：使用某种固相材料如琼脂、硅胶、聚丙烯等，在其表面共价结合相应的抗原，制作成抗原柱。

5. 抗原柱层析：将待分离蛋白质加入到抗原柱中，使其与抗原结合，其他蛋白质被洗掉，得到纯化的蛋白质。

三、优缺点抗原亲和纯化具有许多优点，例如高效、高纯度、高特异性、全程在几个小时内完成等。

此外，该方法对样品来源不敏感，适用于多种来源的样品，包括细胞培养物、组织等。

在制备抗体时，其特异性和亲和力都比其他方法制备的抗体要高。

不过，抗原亲和纯化也存在一些缺点。

首先，制备特异抗体的过程耗时且费用较高。

其次，该方法不适用于无法制备到高质量抗体的蛋白质，如一些小分子等。

此外，抗体的亲和力和特异性有时会受到批次之间的变异，需要对纯化效果进行不断优化。

四、应用抗原亲和纯化具有广泛的应用。

在分子生物学中，该方法广泛用于制备纯化的蛋白质，例如酶、激素等。

第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。

一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。

细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。

细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。

颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。

二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。

1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。

2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。

（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。

（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。

3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。

（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。

（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。

（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。

（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。

选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。

（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。

（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。

（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。

离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。

5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。

如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。

电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。

（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。

抗原制备的实验报告一、实验目的本实验旨在通过制备抗原，提高对特定免疫原的免疫能力，从而进一步认识抗原的制备和应用。

二、实验原理抗原是一种能够激发机体产生特异性免疫应答的物质，通常可分为低分子量和高分子量两类。

低分子量抗原主要是指药物、激素、有机化合物等，而高分子量抗原主要是指蛋白质、多糖、核酸等。

抗原的制备主要包括以下几个步骤：1. 确定抗原：根据实验目的和需要，选择特定的抗原进行制备。

2. 提取抗原：从生物样品中提取目标抗原，常用方法包括细胞裂解、超声破碎、离心、柱层析等。

3. 纯化抗原：使用柱层析、凝胶过滤等技术，将抗原与其他杂质分离，获得纯净的抗原。

4. 浓缩抗原：将纯净的抗原浓缩至适宜浓度，便于后续实验的使用。

三、实验步骤1. 实验准备：清洗实验器材，并将所需溶液按比例配制好。

2. 抗原提取：取适量的生物样品，如细胞液、血清等，进行裂解或超声破碎，释放抗原。

根据需要，可能需要添加蛋白酶抑制剂、麦芽糖等保护剂。

3. 离心分离：将裂解后的样品进行离心，分离固体残渣和上清液。

上清液中含有目标抗原。

4. 柱层析：将上清液加入已经平衡好的层析柱中，根据抗原的特性选择合适的层析介质，如离子交换层析树脂、亲和层析树脂等。

通过洗脱方法，将抗原与其他成分分离。

5. 浓缩：将洗脱后的抗原溶液经过浓缩处理，以获得适用于后续实验的浓缩抗原。

四、实验结果与分析经过实验制备得到的抗原，经过SDS-PAGE电泳分析可见，目标蛋白条带的浓度较高，且无明显的杂带。

通过浓缩抗原，使其浓度达到1000μg/ml，便于后续实验的使用。

五、实验总结通过本次实验，我们成功地制备了目标抗原，并获得了一定浓度的纯净抗原。

本实验中使用的方法可以适用于其他抗原的制备，同时也了解了抗原的重要性及应用。

实验过程中需要注意对实验器材的清洗和消毒，以避免杂质的污染对抗原制备的影响。

六、参考文献[1] 李晓杰，杨立波，陈薇薇，等. 抗原制备及其在抗体制备与检测中的应用进展[J]. 生物技术通讯，2017，28（6）: 900-905.。

第一章1.免疫球蛋白的分类依据是：答案:重链恒定区2.IgG的补体结合位点位于：答案:CH23.各种抗体单体分子共有的特性是：答案:具有两个完全相同的抗原结合部位4.以下哪种技术极大提高了免疫学检测的特异性？答案:标记技术；5.最早用于标记免疫测定的标记物是答案:荧光素6.抗体的基本单位是：答案:由2条相同的重链和2条相同的轻链组成的四肽链结构7.木瓜蛋白酶能将抗体水解成：答案:Fab和Fc8.抗体中与抗原表位互补结合的部位：答案:重链和轻链的高变区9.血清中含量最高的抗体是：答案:IgG10.机体再次免疫应答的主要抗体是：答案:IgG第二章1.抗原抗体结合力中作用最大的是答案:疏水作用力2.用已知抗原或抗体来检测相对应的抗体或抗原，是由于抗原抗体反应具有答案:特异性3.制备免疫血清时，下列说法正确的是答案:早期获得的抗血清亲和力低，特异性好4.抗原抗体反应的特异性是指抗原决定簇和抗体分子什么区结合的特异性答案:超变区5.下列哪种免疫血清与相应抗原结合容易形成可见免疫复合物答案:家兔6.静电引力大小答案:和两个电荷的距离的平方成反比7.一般抗原抗体反应的最适温度为答案:37℃8.下列哪类抗体与相应抗原表位的亲和力最强答案:IgM类9.抗原抗体反应比例不合适出现的沉淀物减少的现象称为答案:带现象10.抗原抗体反应中，抗体的合适浓度是答案:与抗原相对而言第三章1.动物放血应在末次免疫后多长时间答案:5～7天2.制备人工抗原时，最常用于偶联半抗原的载体是答案:牛血清白蛋白3.根据抗原密度大小进行分离纯化的方法为答案:超速离心法4.不属于可溶性抗原制备方法的是答案:超声破碎法5.关于单克隆抗体的说法正确的是答案:特异性高6.用于细胞融合的骨髓瘤细胞不应具备的特征是答案:细胞株本身能分泌免疫球蛋白7.免疫小鼠采血通常采用答案:摘除眼球或断尾法8.具有免疫原性的佐剂为答案:脂多糖9.要从组织和细胞匀浆中粗提某种蛋白抗原，最常用又简便的分离方法是答案:盐析法10.纯化特异性抗体时，可采用下列哪种方法除去杂抗体答案:免疫亲和层析法第四章1.直接抗球蛋白实验用于检测答案:红细胞表面结合的不完全抗体2.关于正向间接凝集抑制试验说法错误的是答案:出现凝集为阳性3.间接抗球蛋白实验用于检测答案:血清中游离的不完全抗体4.在实验时为促使凝集现象的出现，下列措施无效的是答案:胰酶处理5.关于间接Coombs试验，说法错误的是答案:检测红细胞上的不完全抗体6.关于协同免疫凝集试验说法错误的是答案:SPA能与所有IgG亚类的Fc 段结合7.自身红细胞凝集试验所用红细胞是答案:受检者未致敏红细胞8.玻片凝集试验答案:既能检测抗原，又能检测抗体9.协同凝集试验所用的载体是答案:金黄色葡萄球菌10.关于正向间接凝集试验说法错误的是答案:出现凝集为阴性第五章1.单向琼脂扩散法可用于：答案:抗原定量2.对流免疫电泳是：答案:定向加速的双向扩散试验3.滴定抗血清效价时，常选用的双向琼脂扩散试验的模式为答案:梅花孔型。