霍乱弧菌的检验程序

霍乱弧菌实验室检测SOP手册1.标本的采集和送检1.1.标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。

为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。

标本以病人大便为主。

采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入3㎝～5㎝采集。

一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。

有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。

带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。

1.2.标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。

不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。

并立即送检验室。

1.3.标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。

标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。

也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。

送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。

2.检验方法2.1.培养方法2.1.1.增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。

碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。

保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。

培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。

标本含菌少时，可实行二次增菌。

取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。

2.1.2.分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。

其它标本均应增菌后再做分离培养。

当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。

第十五章弧菌科及检验本章内容一、弧菌属（一）霍乱弧菌（二） O139 型霍乱弧菌（三）副溶血性弧菌（四）其他弧菌二、气单胞菌属与邻单胞菌属（一）气单胞菌属（二）邻单胞茵属革兰阴性直杆菌或弧菌有极端鞭毛氧化酶阳性动力阳性发酵葡萄糖弧菌属——分类根据细菌的抗原性、生化特性、DNA同源性、致病性和耐盐性等将弧菌分为四类：① O1群霍乱弧菌；②不典型O1群霍乱弧菌 : 能被 O1群血清凝集但不产生致病毒素；③非 O1 群霍乱弧菌；④其他弧菌：包括副溶血性弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、创伤弧菌、麦氏弧菌和拟态弧菌。

大多数为非病原菌，对人类致病的主要有霍乱弧菌和副溶血性弧菌，分别引起霍乱和食物中毒。

霍乱弧菌——生物学特性形态与结构形态：弧形或逗点状，“鱼群状”。

人工培养后呈杆状。

染色： G-。

特殊结构：有菌毛，无芽胞，部分有荚膜。

一端有一根粗而长的鞭毛，悬滴观察可见穿梭样或流星状运动。

·培养特性营养要求：不高，可无盐生长。

气体环境：兼性厌氧。

菌落特征：耐碱不耐酸。

pH8.5 的碱性蛋白胨水：培养6～ 9h，增菌形成菌膜。

碱性琼脂平板：较大圆形扁平、无色透明或半透明似水滴状菌落。

硫代硫酸盐 - 柠檬酸盐 - 胆盐 - 蔗糖琼脂平板（ TCBS）：较大黄色菌落。

亚碲酸钾琼脂平板：还原亚碲酸钾成金属碲，使菌落中心呈灰褐色。

庆大霉素琼脂：形成的菌落中心呈灰褐色。

·抗原·变异性：有形态变异、菌落变异、溶血性变异和毒力变异。

霍乱弧菌——微生物检验及鉴定·标本采集：以粪便（米泔水样便）为主，尽可能在用药之前采取。

及时接种适宜培养基。

常用的保存或运送培养基有碱性蛋白胨水、文- 腊二氏保存液和卡 - 布运送培养基等。

·形态学检查：①动力观察：米泔水样粪便悬滴观察可见流星或穿梭状运动的细菌。

②制动试验：加霍乱多价诊断血清后弧菌凝集，运动停止。

③涂片染色：革兰染色，观察革兰染色阴性呈鱼群状排列的弧菌。

霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。

2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。

3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。

4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。

霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。

病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。

二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。

需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。

（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。

三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。

霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法微生物学诊断由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。

直接镜检采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。

镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。

细菌分离培养可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。

特异性制动试验取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。

免疫荧光试验除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。

1.标本采集和运送:霍乱是烈性传染病,凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断.在发病早期,尽量在使用抗菌药物之前采集标本.可取患者”米泔水”样便,也可采取呕吐物或尸体肠内容物,或采取肛门试子.标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门试子直接插入卡-布运送培养基中.送检标本装在密封,不易破碎的容器中,置室温由专人输送.甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送.2．标本直接检查:荚膜肿胀试验：特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀的试验常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等的检测革兰染色：革兰染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。

2、媒染剂其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。

常用的媒染剂是碘液。

3、脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。

利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。

革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。

常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。

霍乱弧菌的检验程序临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。

具体处理方法如下。

1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。

疑似者即予电话报告2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）4.35℃孵育上述所有平板及胨水5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。

立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。

如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。

6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。

自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。

将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。

菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。

为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集。

将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。

霍乱弧菌的检测1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。

悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。

2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。

霍乱弧菌检测的方法与结果探究摘要目的：探究分离培养法和胶体金免疫层析法，两种霍乱弧菌检测方法和结果差异。

方法：从2015年至2016年，选取608例霍乱弧菌样本，同时使用分离培养法和胶体金免疫层析法进程检测，并就两种方法的结果符合率进行比较。

致性为优，符合率定位100%。

结果：608例霍乱弧菌样本中，培养法阳性20例，胶体金免疫层析法检测结果与培养法一致为阳性；培养法阴性588例，胶体金免疫层析法检测585例为阴性，3例为阳性，经培养法复核，确定3例为阴性。

结论：胶体金免疫层析法作为一种新兴的霍乱弧菌检测方法，可以快速完成霍乱弧菌的检测，且具有较高的准确性，将其应用于霍乱弧菌检测，可有效提高疫情防控质量。

关键词霍乱弧菌；检测的方法；结果霍乱弧菌（V.cholera）是霍乱的病原体，属于弧菌科，是革兰氏阴性菌的一种。

霍乱弧菌主要分为埃尔托生物型（EL-Tor bio-type）和古典生物型（Classical biotype）两种。

培养法是卫生部规定的霍乱弧菌标准方法，适用于各种霍乱弧菌标本，检测结果准确、可靠，但整体检测时间相对较长。

近几年，胶体金免疫层析法被提出用于霍乱弧菌标本检测，与培养法相比，胶体金免疫层析法检测更加快速。

本文针对两种检测方法进行对比，实验结果如下。

1材料与方法1.1材料pH8.6碱性蛋白胨水（杭州微生物试剂厂）；TCBS（硫代硫酸盐枸橼酸盐胆盐琼脂）；霍乱弧菌O1群多价血清和小川稻叶O139分型血清（浙江省疾病预防控制中心）；霍乱弧菌胶体金免疫快速检测卡（郑州博赛生物技术有限公司）。

所有试剂均在有效期以内。

1.2样本来源本组试验中608例霍乱弧菌样本，均收集于疑似霍乱感染者粪便以及霍乱疫情采集标本。

试验中检测为阳性的霍乱弧菌样本，均送至相关疾病预防控制中心进一步确认（其中呕吐物2份，肛拭18份）。

其余腹泻患者肛拭988分，均通过培养法检测验证为阳性。

1.3方法根据《霍乱防治手册》（第五版）规定进行病原菌分离培养和血清鉴定；胶体金免疫层析法操作方法如下：一，采取适量以增菌的碱性蛋白胨水滴入检测卡中，均匀摇晃，观察5min内的试验结果。