生殖细胞中的细胞凋亡共28页文档
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生命科学学院专业生物技术 2016级生技班612组姓名同实验者 2018年 4 月 23日题目:秀丽线虫生殖细胞凋亡检测一.实验目的:1.掌握检测凋亡细胞的方法2.学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤二.实验原理1.秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans):是一种无毒无害、可以独立生存的线虫。
其个体小,成体仅 1.5mm长,为雌雄同体(hermaphrodites),雄性个体仅占群体的0.2%,可自体受精或双性生殖;在20℃下平均生活史为3.5天,平均繁殖力为300-350个;但若与雄虫交配,可产生多达1400个以上的后代。
1976年,Sulston和Horvitz利用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)研究发现,其约13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡,使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。
2.荧光染料活体染色:本实验使用吖啶橙(Acridine orange)作为染色剂,该染料对细胞具有慢性毒性,致癌性强,由于凋亡细胞因DNA片段化可结合更多染料,荧光显微镜下呈亮绿色,可在荧光显微镜下快速方便的检测出,适用于多数品系。
生命科学学院专业生物技术 2016级生技班612组姓名同实验者 2018年 4 月 23日三.实验材料及设备1.实验材料:a)各品系秀丽隐杆线虫:N2(实验组), ced-1::gfp(方法对照组),ced-3(阴性对照)b)OP50c)M9培养基d)NGM培养基2.实验设备:a)普通光学显微镜b)载玻片若干,盖玻片若干,铂金丝c)暗箱d)吸水纸、滴管等e)荧光显微镜四.实验方法及步骤1.线虫接种、同步化2.取样:在12孔板培养板上,每孔吸取900μL预先接入少量OP50的M9培养基,每孔用铂金丝挑取培养20~30条成体线虫3.染色:向N2与ced-3品系中每孔加入250μg/mL吖啶橙100μL,混匀后置于培养箱(避光)染色45~60min。
生精细胞凋亡的基因调控摘要】生精细胞凋亡受大量基因共同调控,深入研究睾丸生精细胞的凋亡及其基因调控是进一步了解生精细胞凋亡机制和其生物学过程的关键所在,对阐明精子发生的生理、病理及探讨男性不育有重要的意义。
【关键词】生精凋亡基因细胞凋亡是机体在生长、发育和受外界刺激时,清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡的一种自我调节机制。
细胞凋亡的发生是由于内外环境的变化或死亡信号的触发,在基因调控下所发生的一系列细胞主动死亡的过程。
睾丸生精细胞凋亡是一个非常复杂的过程,需要众多的因子协调参与来完成细胞的程序化死亡。
本文结合近年来生精细胞凋亡的研究进展,对其凋亡中的基因表达调控作用做一综述。
1. Bcl-2家族Bcl-2家族是与细胞凋亡关系密切的原癌基因家族之一。
现今研究比较多和深入的是Bcl-2和Bax。
Bcl-2属于抑制细胞凋亡的基因,主要定位于精母细胞,支持细胞和间质细胞。
Bax则属于促进细胞凋亡的基因,在各级生精细胞均有弱表达。
相关研究证实Bcl-2和Bax在细胞内是以同源二聚体或异源二聚体形式存在的。
如可形成Bax/Bax同源二聚体促进生精细胞凋亡。
同时,bax基因也可竞争性地与Bcl-2蛋白结合,形成Bcl-2/Bax异源二聚体,Bcl-2/Bax的比例决定是否发生凋亡。
手术诱导的隐睾中发现,生精细胞凋亡增加,Bcl-2表达下调,而Bax表达上调。
而输精管结扎后Bcl-2在精原细胞和精母细胞中的表达减少,而Bax表达增强,结扎后生精细胞的凋亡增加。
还有Guo[1]等发现的Bcl-2基因家族新成员—Bcl-G很可能是睾丸生精细胞凋亡特异相关蛋白。
2. p53基因p53基因也是一种凋亡相关基因,在人类精原细胞和初级精母细胞中都有明显的p53表达。
正常p53基因即野生型p53具有促进细胞凋亡的作用,而突变型p53基因则具有抑制细胞凋亡的作用。
基因表达可促进或抑制细胞凋亡的发生,但是,在多数情况下,单一基因表达的变化不足以影响细胞凋亡,需要几种基因协同作用,共同调节凋亡过程。
生精细胞凋亡及其相关内容细胞凋亡又叫程序性细胞死亡,是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。
细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的,其具体的过程机制尚不明确,Bcl-2 是一种细胞膜蛋白,主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上,高水平的Bcl-2 蛋白有抑制细胞死亡等作用,是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白。
Tanaka等证实Bcl-2 能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。
CytC 是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质,而Bax、Bak可与Bcl-2结合,止其对CytC释放孔道的抑制作用,从而促进CytC从线粒体释放,引起凋亡。
CytC通过接头分子使caspase(胱冬肽酶)分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。
caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。
正常情况下,caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。
caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。
检测生精细胞凋亡的技术4.1 形态学检测透射电镜检测:处死大鼠,取出睾丸。
取出左侧睾丸少量组织,迅速在冰浴上切成1mm×1mm×2mm小块,置于预冷的2%戊二醛溶液中固定,标本经锇酸固定、脱水、树脂包埋、超薄切片和醋酸双氧铀染色后,在透射电镜下观察。
可见细胞质空泡化,核膜增厚,核周隙增宽;染色质浓缩,附着于核边缘呈新月形;严重者染色质固缩、断裂, 出现凋亡小体。
4.2 琼脂糖凝胶电泳通过观察DNA梯状电泳带或定量检测DNA片段,可测定凋亡。
凋亡细胞DNA 在核小体连接处规律性降解,形成以180 bp一200 bp为最小单位的寡聚体片段,琼脂糖凝胶电泳时呈典型的“梯状带”。
但Singh等琼脂糖凝胶电泳检测到青年人生精细胞DNA迁移呈圆形,老年人凋亡生精细胞DNA迁移呈彗星状。
细胞凋亡与女性生殖分析进展关键字:细胞凋亡生殖细胞凋亡,亦称程序性死亡,是进化上细胞自杀的保守性程序,它对调节细胞自然丢失和组织自身平衡有着重要作用。
现已证实,从细菌、无脊椎动物、脊椎动物一直到人,细胞凋亡现象普遍存在。
凋亡细胞的典型特征为:染色质固缩;基因组脱氧核糖核酸(DNA)降解,形成单个或多个核小体的片断,在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈典型“梯状”条带;凋亡小体的形成。
凋亡小体和“梯状”条带已成为鉴定凋亡细胞的主要实验手段。
最近几年,对细胞凋亡机制的研究已取得很大进展,本文对女性生殖过程中细胞凋亡的研究作一综述。
一、卵巢颗粒细胞的凋亡卵巢为一动态组织,在每个月经周期中许多卵巢开始发育,但仅一个或两个卵泡占优势而排卵。
在卵泡闭锁期间,大多数卵泡死亡,这些生理活动可能与细胞凋亡有关。
有关卵巢颗粒细胞(ranulosa cells’GCs)凋亡的研究已十分深入。
现已证实,多种基因参与了细胞凋亡[1~3]。
其中,Bax、p53、WT-1(wilm’s tunor type1)、Fas、Bcl-XShort等基因有促进细胞凋亡的作用,而Bcl-2、Bcl-Xlong 等基因起抑制细胞凋亡的作用,且它们的作用皆受促性腺激素中促黄体生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)的调控。
促性腺激素分别通过抑制GCs凋亡。
而促性腺激素释放激素(GnRH)及其激动剂(GnRHa)以及睾酮(T)却对GCs凋亡起诱导作用。
提示人GCs凋亡主要受体液因素的调节。
除了基因水平的调节外,GCs凋亡的细胞内机制可能与caspases凋亡途径有关。
caspases为一半胱氨酸蛋白酶家族,它对底物中天冬氨酸有特异性,它的活化是底物内部天冬氨酸残基断裂所必须的。
编码caspases的基因与线虫遗传学中定性的凋亡基因具有同源性。
已显示,在小鼠和母牛GCs和黄体细胞中caspase-1和caspase-3表达。
最近,Lzawa等[4]用逆转录多聚合酶链反应(RT-PCR)证实了人GCs中caspase-1、caspase-3、凋亡相关蛋白酶激活因子-1、DNA断裂因子等基因转录物的存在,同时用Western印迹证实了caspase-1、caspase-3蛋白前体的存在。
细胞凋亡死亡是生命的普遍现象,但细胞死亡并非与机体死亡同步。
正常的组织中,经常发生“正常”的细胞死亡,它是维持组织机能和形态所必需的。
一、细胞死亡的方式细胞死亡的方式通常有3种:即①细胞坏死。
②。
③细胞程序性死亡。
(一)、细胞坏死是细胞受到急性强力伤害时立即出现的早期反应。
包括胞膜直接破坏,大量水进入细胞,线粒体外膜肿胀而密度增加。
核染色质呈絮状,蛋白质合成减慢。
如及时去除伤害因素,以上早期反应尚可逆转。
若伤害外因持续存在,则发生不可逆的变化。
Ca2+升高、引起一系列变化,如细胞骨架破坏,溶酶体释放,PH下降,最后细胞膜和细胞器破裂,DNA降解,细胞内容物流出,引起周围组织炎症反应(图15-7)。
图15-7 细胞坏死与凋亡的形态区别(二)、细胞凋亡细胞凋亡(cell apoptosis)是借用古希腊语,表时细胞象秋天的树叶一样凋落的死亡方式。
1972年Kerr 最先提出这一概念,他发现结扎大鼠肝的左,中叶门静脉后,其周围细胞发生缺血性坏死,但由肝动脉供应区的实质细胞仍存活,只是范围逐渐缩小,其间一些细胞不断转变成细胞质小块,不伴有炎症,后在正常鼠肝中也偶然见到这一现象。
与细胞坏死的区别是:①染色质聚集、分块、位于核膜上,胞质凝缩,最后核断裂,细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体(图15-8);②凋亡小体内有结构完整的细胞器,还有凝缩的染色体,可被邻近细胞吞噬消化,因始终有膜封闭,没有内溶物释放,故不会引起炎症;③线粒体无变化,溶酶体活性不增加;④内切酶活化,DNA有控降解,凝胶电泳图谱呈梯状;⑤凋亡通常是生理性变化,而细胞坏死是病理性变化。
图15-8 左,正常胸腺细胞;右,凋亡胸腺细胞(注意凋亡小体)在细胞凋亡一词出现之前,胚胎学家已观察到动物发育过程中存在着细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)现象,近年来PCD和细胞凋亡常被做为同义词使用,但两者实质上是有差异的。