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POD 、PPO 活性测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4•12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容B ：NaH 2PO4•2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 0.05mol ·l -1 PH7.8 915 ml A+ 85mlB 1000ml1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 10gPVP ——加PBSPH7.8——1000ml （用来提取酶液）②愈创木酚（即0.02mol ·l -1邻甲氧基苯酚） ③30%H 2O 2④25mmol ·l -1焦性没食子酸（焦培酸）POD 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加入 28μl （愈创木粉）加入19μl30%H 2O 2 棕色瓶PPO 反应液：取50ml0.05mol ·l -1PH6PBS 加入 100μl 焦培酸 棕色瓶酶液提取：称取0.5g 样品放入研钵，分三次共加8ml1%PVP 冰浴研磨 全部倒进离心管 放进离心机 4℃、10000r ·min 离心15min →取上清夜备用（1）POD 测定：3ml 反应液μl 酶液 混匀 A470比色 (以反应液做对照) 每一分钟记录一次计算：POD 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD470×N 总体积/t ×n ×w ×0.01（2）PPO 测定：3ml 加入 100μl 酶液 混匀 30℃水中15min A420比色(以反应液做对照)计算：PPO 活性（U ·g -1FW ·min -1）=OD420×N 总体积/t ×n ×w ×0.001（反应液调零点，一个酶单位u 定义为0.001A 值变化）POD 、PPO 、多酚氧化酶的测定试剂：磷酸缓冲液（代号PBS ）配制A ：Na 2HPO 4•12H 2O 17.91g 加水 1000ml 定容B ：NaH 2PO4•2H 2O 7.8g 加水 1000ml 定容 0.05mol ·l -1PH6PBS 123mlA+877mlB 1000ml 定容即可 1%PVP （聚乙烯吡咯烷酮） 1gPVP 100ml 定容②愈创木酚（即0.05 mol ·l -1邻甲氧基苯酚）:取0.6208 g 的愈创木酚定容到100ml 容量瓶摇匀即可③0.1mol/LH2O2 5.68ml 稀释至1000ml ④25mmol ·l -1焦性没食子酸（焦培酸）⑤0.1mol/L 儿茶酚溶液：取0.5506克儿茶酚溶于50毫升蒸馏水中，定容摇匀即可。
实验七植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
一、实验目的
掌握植物组织内过氧化物酶活性测定的原理和方法。
二、实验原理
过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。
三、实验材料与设备
1．实验设备与仪器
电子天平、冰冻高速离心机、可见光分光光度计、电动玻璃匀浆剂等。
2．实验材料与试剂
20mM KH2PO4，
100mM PBS：取0.2M Na2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。
反应液：取100mM PBS 50ml，加入愈创木酚28μl，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H2O219μl，混合均匀保存于冰箱中备用。
四、实验步骤
1．酶液制备
取1.0g植物叶片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的20mM KH2PO45ml进行冰浴研磨提取。
匀浆液低温离心8500rpm 15min，上清液为酶粗提液，定容到50ml供测定。
2．酶活性测定
取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mMKH2PO41ml作为调零管。
另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。
3．计算
以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g鲜重）。
可见光的范围350-770，紫外A 400-315nm，B 315-280nm，C 280-190nm酶活单位=△ODmg一1·FW·min一11. POD活性测定：称取组织1g放于研钵中，加5mL0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH5.5）在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4℃条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4℃保存备用。
取酶液100μL，加反应混合液1. 2.9ml 0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)2. 1mL 0.05mol/L愈创木酚溶液，0.05mol/L愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml3. 1.0 ml 2%H2O2, 30% H2O2670μL，加水至10ml.在37℃水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。
以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。
酶活计算: OD290。
g- 1.FW.h- 1=OD变化值/材料鲜重/反应时间POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关2. CAT活性测定：设置两个重复一个对照,测定体系包括1. 0.2 ml酶液、2. 1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、3. 1 ml蒸馏水，4. 25℃预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H2O2 (30% H2O256.8μL加水至10ml.)在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读一次，共测3 min，以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。
3. SOD活性的测定：采用改进的高灵敏度的氯化硝基氮兰四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。
每处理取3个小烧杯，分别加入3mLSOD反应液（参照附录B），A）0.lmol/L pH7.8磷酸缓冲液准确称取0.72gNa2HPO4·12H2O溶于20ml水中取18.3mL；准确称取0.312gNaH2PO4·2H2O 溶于20mL水中取1.7mL，混合并定容至20mL。
SOD、CAT、POD等的活性测试方法SOD、CAT、POD测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4?12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4?2H2O（分子量156.01）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
植物体POD的测定※<原理>了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。
过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。
※<实验材料、试剂与仪器设备>1、实验仪器722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］3、实验材料任何植物材料※<实验步骤>1、粗酶液的提取称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。
2、酶活性的测定取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。
以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。
※<结果计算>以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鲜重)]表示之。
也可以用每min 内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。
过氧化物酶活性[u/(g.min)]=式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。
W——植物鲜重，g。
VT ——提取酶液总体积，mL。
Vs ——测定时取用酶液体积,mL。
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
第1篇一、实验目的1. 理解同工酶的概念及其在生物体中的生物学意义；2. 掌握同工酶电泳技术的基本原理和方法；3. 通过同工酶电泳实验，观察和分析同工酶在样品中的分布情况。
二、实验原理同工酶是指具有相同催化功能，但氨基酸序列和分子结构不同的酶。
同工酶电泳技术是一种分离和鉴定同工酶的方法，其原理是利用同工酶在电场中的迁移速率差异，将其分离。
三、实验材料1. 实验样品：植物叶片、动物组织等；2. 电泳试剂：琼脂糖、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等；3. 电泳仪器：电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等；4. 其他：移液器、吸管、剪刀、镊子等。
四、实验方法1. 样品制备：将实验样品研磨，加入适量提取液（如Tris-HCl缓冲液），在冰浴中匀浆，离心取上清液；2. 电泳凝胶制备：按照电泳试剂的配方，制备琼脂糖凝胶；3. 电泳样品制备：将提取液加入适量的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺，混合均匀后，加入适量的样品，制成样品胶；4. 电泳：将制备好的样品胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，进行电泳；5. 成像与分析：电泳结束后，取出凝胶，用凝胶成像系统拍照，分析同工酶的分布情况。
五、实验结果1. 通过电泳实验，观察到样品中存在多种同工酶；2. 不同样品的同工酶分布情况存在差异，说明同工酶在生物体中具有特异性；3. 同工酶的迁移速率与酶的分子量有关，分子量较小的酶迁移速率较快。
六、实验结论1. 同工酶在生物体中具有重要作用，其生物学意义包括催化、调控、信号传递等；2. 同工酶电泳技术是一种有效的分离和鉴定同工酶的方法；3. 本实验成功分离和鉴定了样品中的同工酶，为后续研究提供了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，样品制备和电泳操作应注意无菌操作，以避免污染；2. 电泳条件的选择对同工酶的分离效果有较大影响，应根据实验目的和样品特点进行优化；3. 同工酶的研究有助于揭示生物体的遗传、变异和进化规律。
八、实验总结本实验通过同工酶电泳技术，成功分离和鉴定了样品中的同工酶，验证了同工酶在生物体中的生物学意义。
