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第八章细胞培养常用技术一：分子杂交技术

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分子生物学技术总结1

分子生物学技术总结1

分子生物学技术总结关键词：分子技术原理应用摘要:本文主要是描述分子生物学技术的基本原理，通过其原理我们可以深刻的理解其功能还有实际操作的过程。

另外还列举了每项技术所给我们带来的好处及其现实的应用，通过实际的例子我们可以清楚的了解到其强大的功能和深远的影响以及将来的发展前景，充分体现出了科技给人类带来的创新及利益，可以说分子生物学技术将会改变人类未来的生活环境和生活条件，为人类的长期发展起到了不可替代的作用。

下文将详细的介绍部分分子生物学的技术及其应用。

1.核酸分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。

杂交的双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。

核酸探针是指用放射性核素，生物素或其他活性物质标记的能与待定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。

根据其来源和性质可分为CDNA探针，基因组探针，寡核苷酸探针，RNA探针等。

其应用：核酸分子杂交技术可以用来诊断弓形虫病分子。

2．寡核苷酸微点隈杂交：是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使他共价结合与持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。

应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。

适用于低丰度mRNA的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。

但有工作量较大，成本较高，速度较慢的弱点。

其作用：激发细胞潜在的活性，寡核苷酸一方面能激发巨噬细胞的活性，巨噬细胞相当于城市里的“大垃圾车”。

专门处理衰老和死亡细胞。

另一方面，寡核苷酸就像一把剪刀，定位寻找并及时剪断病毒基因链，快速吞噬病毒细胞，阻止病毒基因的转录和翻译，保护正常细胞不受侵害。

3.分子克隆技术：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。

常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术一、 概述前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。

杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。

分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA 的二条单链之间进行。

由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。

使单链聚合双链的过程称为退火或复性。

用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。

核酸杂交技术基本上是Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。

该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。

Bolton 等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。

变性DNA固定在琼脂中，DNA不能复性，但能与其它互补核酸序列杂交。

典型的反应是用放射性标记的短DAN或RNA 分子与胶中DNA杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针，在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。

该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。

60年代末，Britten等设计了另一种分析细胞基因组的方法。

该法是研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，典型的方法是：从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离DNA，用水压器剪切成长约450核苷酸（nt）的片段。

剪切的DNA液（含0.12mol/L 磷酸盐缓冲液或0.18mol/l Na+），经煮沸使dsDNA热变性成ssDNA。

然后冷至约60℃，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的UV260nm的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。

核酸分子杂交技术2016-李

核酸分子杂交技术2016-李

核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍有可 能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰物的性质。
标记的探针每 1kb只掺入10-30个修饰碱基，仅4％-12
％的单个碱基被修饰的类似物取代。 尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对类
根据标记方法不同可分为： 放射性探针 非放射性探针 根据核酸的性质不同又可分为： DNA探针 单链(ssDNA) 双链(dsDNA) RNA探针 cDNA探针 cRNA探针 原 位 杂 交 可 分 为 DNA-DNA ， cDNA-RNA ， RNARNA和寡核苷酸与DNA或RNA等杂交方式。
SA：streptavidin(链霉亲合素) BAP：生物素化的磷酸酶 B：biotin(生物素), ABC:avidin-botin-enzyme complex(亲合素-生物素-酶复
合物)。
4.非放射发光自显影 若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种
酶解后产生的光子的化合物，可用自显影技术曝光X线片
亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中，合成后此活化的寡核苷酸与AP
即得到AP标记的寡核苷酸。
6. DNA半抗原标记
其原理与Bio-11-dUTP相同 ，只是用毛地黄甙抗体检测标记
在DNA上的半抗原分子地高辛（Digoxigenin，DIG）。
（三）非放射性探针的显示体系 1. AP显色体系 ASO-AP+BCIP→BCI-OH+Pi BCI-OH+NBT→紫色
核酸分子杂交技术
李如波
中国医科大学法医学院
核酸分子杂交技术 (Nucleic acid molecular hybridization)是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。 不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补序列， 即可按碱基配对规则以氢键相结合。通常是先对一种核酸 进行标记（如放射性同位素 35S，32P或生物素等）作为探 针，去探测另一种核酸序列。核酸分子杂交可以在 DNA 与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行。

2020年智慧树知道网课《临床分子生物学检验技术(哈尔滨医科大学)》课后章节测试满分答案1

2020年智慧树知道网课《临床分子生物学检验技术(哈尔滨医科大学)》课后章节测试满分答案1

绪论单元测试1【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科建立在分子生物学学科之前。

A.对B.错2【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术是从分子水平研究解决临床诊断与治疗问题。

A.对B.错3【多选题】(20分)现代临床医学的发展方向：（）A.预测医学B.预防医学C.个体化医学D.中西医结合4【多选题】(20分)下列技术为临床分子生物学检验常用检测技术的是（）A.基因测序B.SouthernblotC.分子杂交D.其余均不对5【判断题】(20分)临床分子生物学检验技术学科发展第一阶段的代表性技术为分子杂交技术。

A.错B.对第一章测试1【单选题】(20分)在人类基因组DNA序列中，DNA甲基化主要发生在（）A.鸟嘌呤的N-7位B.鸟嘌呤的C-5位C.胞嘧啶的C-5位D.胞嘧啶的N-4位E.腺嘌呤的N-6位2【单选题】(20分)下列DNA序列中的胞嘧啶（）易发生甲基化修饰的是。

A.5'-CGCGCG-3'B.5'-GGGGCC-3'C.5'-CCCCCT-3'D.5'-GCACAC-3'E.5'-CTCTCCC-3'3【单选题】(20分)某基因位点正常时表达为精氨酸，突变后为组氨酸，这种突变方式为（）A.移码突变B.动态突变C.无义突变D.同义突变E.错义突变4【单选题】(20分)由于突变使编码密码子形成终止密码，此突变为（）A.无义突变B.移码突变C.终止密码突变D.同义突变E.错义突变5【单选题】(20分)下列叙述哪项是的（）A.原核生物基因组具有操纵子结构B.原核生物结构基因是断裂基因C.原核生物结构基因的转录产物为多顺反子型mRNAD.原核生物基因组中含有插入序列E.原核生物基因组中含有重复顺序第二章测试1【单选题】(20分)DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A.T－G含量B.A－G含量C.A－C含量D.A－T含量E.G－C含量2【单选题】(20分)Southern杂交通常是指（）A.DNA和RNA杂交B.DNA和蛋白质杂交C.蛋白质和蛋白质杂交D.RNA和RNA杂交E.DNA和DNA杂交3【单选题】(20分)下列哪些不是影响DNA复性的因素（）A.碱基组成B.DNA浓度C.温度D.DNA的分子量E.DNA的来源4【单选题】(20分)探针基因芯片技术的本质就是（）A.基因重组技术B.蛋白质分子杂交技术C.酶切技术D.聚合酶链反应技术E.核酸分子杂交技术5【单选题】(20分)DNA探针的长度通常为（）A.1000～2000个碱基B.400～500个碱基C.<100个碱基D.500～1000个碱基E.100～400个碱基第三章测试1【单选题】(20分)以mRNA为模板合成cDNA的酶是()A.DNA酶B.逆转录酶C.RNA酶D.限制性内切酶E.TaqDNA聚合酶2【单选题】(20分)有关PCR的描述下列不正确的是（）A.引物决定了扩增的特异性B.由变性、退火、延伸组成一个循环C.循环次数越多产物量就越大，可增加循环次数提高产物量D.是一种酶促反应E.扩增的对象是DNA序列3【单选题】(20分)下列关于TaqDNA聚合酶的描述，的是（）A.扩增的DNA片段越长，碱基错配率越低B.催化形成3´,5´-磷酸二酯键C.不具有3´5´外切酶活性D.使DNA链沿5´→3´方向延伸E.以dNTPs为原料4【单选题】(20分)PCR反应过程中，退火温度通常比引物的Tm值（）A.低15℃B.高5℃C.低5℃D.相等E.高15℃5【单选题】(20分)PCR反应中延伸的时间取决于（）A.待扩增片段的长度B.模板的含量C.模板的纯度D.TaqDNA聚合酶的量E.引物长度第四章测试1【单选题】(20分)关于TaqMan探针技术的描述，不正确的是（）A.解决了荧光染料技术非特异的缺点B.R基团与Q基团相距较远，淬灭不彻底，本底较高C.易受到TaqDNA聚合酶5′-3′核酸外切酶活性的影响D.无需进行寡核苷酸熔解曲线分析，减少了实验时间E.操作亦比较简单2【单选题】(20分)以下为比较Ct法的相对定量的描述，不正确的是（）。

分子杂交技术

分子杂交技术

分子杂交技术(总50页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--分子杂交技术分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。

杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。

杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。

该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。

根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。

探针必须经过标记，以便示踪和检测。

使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。

核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。

因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。

第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。

下面将介绍各种类型的探针及标记方法。

一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。

双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。

1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。

同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。

由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。

分子生物学常用技术一 核酸分子杂交技术

分子生物学常用技术一 核酸分子杂交技术

核酸杂交常用几种膜的性能比较
（2）Southern印迹的常用方法 印迹的常用方法 A.毛细管虹吸印迹法 毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用， 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 转移到固相支持物上。 的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 转移到固相支持物上 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬 和柠檬 容器中的转移缓冲液含有高浓度的 酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤 酸钠， 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动， 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动， 同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝 片段垂直向上运动， 同时带动凝胶中的 片段垂直向上运动 胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上 胶中的 片段移出凝胶而滞留在膜上
第四部分
分Hale Waihona Puke 生物学常用技术第一节 核酸分子杂交技术
一、核酸分子杂交的基本原理 • 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 核酸序列称探针。 核酸序列称探针。 • 杂交有固液相杂交和液相杂交。 杂交有固液相杂交和液相杂交。 固液相杂交 杂交
（2）复性过程 ） A.单链分子间碰撞形成局部双链 单链分子间碰撞形成局部双链 B.局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 局部双链周围的碱基如不配对时， 局部双链周围的碱基如不配对时 C.局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 局部双链周围的碱基如配对， 局部双链周围的碱基如配对 D.形成完整的双链分子 形成完整的双链分子
2、待测DNA样品的电泳分离 、待测 样品的电泳分离 （1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 ）琼脂糖浓度： 分离小片段用高浓度胶 （2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 ）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应， DNA泳动慢 小分子 泳动慢,小分子 泳动快， 泳动慢 小分子DNA泳动快， 泳动快 大小 相同的分子处于同一条带 消化的λDNA，杂 （3）分子量标准：经HindⅢ消化的 ）分子量标准： ， 交所用分子量标准可用核素标记

第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件


烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
第二节 植物原生质体培养的发展与意义
原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别 值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功 （Spangenberg等，1986）。
利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原 生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体 的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究 也是有利的（Schweigo等，1987）。
饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、 玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。 已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂 （Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程 的观察。
第一节
植物原生质体的定义及特点
（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。
外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、 叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的 理想工具。
（6）变异为单细胞，变异性状易纯。
原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单 细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更 纯。
第三节 植物原生质体培养方法
2、酶法分离原生质体： 即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生
质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。 常用的细胞壁降解酶种类有：纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶 胼胝质酶、EA3-867酶等。 国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研 究所产）。
特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水 稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987； Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海 波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱 的原生质体培养都已相继成功。

核酸分子杂交技术简介及其应用

班级生物硕01 姓名牛浩学号 20172120470核酸分子杂交技术简介及其应用摘要：本文简要介绍了核酸分子杂交技术的基本概念及其原理，它的杂交类型，包括斑点杂交、细菌的原位杂交技术、Southern吸印杂交和Northern吸印杂交。

探讨了核酸分子杂交技术的研究应用，最后对核酸分子杂交技术做出了相应的研究展望。

关键词：核酸分子杂交技术；概念；原理；杂交类型；研究应用；展望1 基本概念及原理核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化学、分子生物学和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。

也是现阶段定性、定量和定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。

由于其特异性强，灵敏度高、定位准确等优点，目前已被广泛应用于分子生物学、生理学、遗传学、病毒学等基础学科的研究。

DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。

在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。

加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。

变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。

在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度T m。

T m值得大小取决于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其T m值越高。

因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键[1]。

变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。

根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。

杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。

第八章_细胞培养常用技术一：分子杂交技术


Excessive diffuse signal!!
Trouble shooting-3
Southern Blot 操作步骤：
DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 洗膜 预杂交
杂交（变性探针）
放射自显影或显色
（二）Northern Blot
• 原理： 在变性条件下将待检的RNA
样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照 同Southern Blot相同的原理进行转膜 和用探针进行杂交检测。
操作过程
Blotting Southern Northern Western
Sample
Hybridization molecule
DNA
DNA-DNA
RNA
Protein
RNA-DNA Protein-Protein (Ag-Ab)
二、核酸分子杂交
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在 一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
•Western Blot为什么必须要用内参： •要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的 蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞、等量
的上样量，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样
量的差别就很可能影响结果的分析。 •常用的蛋白质内参有：GAPDH（glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin 或beta-tubulin。
主要试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr/Bis）过滤后臵棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 (2) 10%SDS (3) 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 (4) 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液： (5) 0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液： (6) 10%过硫酸铵(AP) (7) TEMED（四甲基乙二胺） (8) 样品溶解液 (9) 固定液、染色液和脱色液 (10)电极缓冲液 (11) 转印缓冲液 (12)检测系统－显色系统 (13)显影系统

医学分子生物学原理-分子杂交和印迹技术

最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。
2020年3月4日1时8分
15
DNA切口平移标记法示意图
DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链DNA上随机打开 若干个单链缺口， 产生3’-OH端。
大 肠 杆 菌 DNA 聚 合 酶 Ⅰ ： 5’→3’ DNA聚合酶活性； 5’→3’ 外 切 核 酸 酶活性。
➢ 将这些菌落归并到一个琼脂主平板，第二个琼 脂平板表面铺一张硝酸纤维素滤膜。经培养一 段时间后，对菌落进行原位裂解。
2020年3月4日1时8分
6
核酸分子杂交应用
（1）特定基因序列的定性和定量分析 （2）基因克隆的筛选 （3）酶切图谱的制作 （4）基因突变分析 （5）疾病的诊断
2020年3月4日1时8分
7
二、探针的种类和制备
探针(probe)的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列
的DNA或RNA的互补标记片段：
5′ 3′ 5′
3′
53′′ 5′
3′
2020年3月4日1时8分
3′ 5′ 限制性内切酶
3′ 5′
Klenow DNA聚合酶
完整双链DNA
5 ′末端突出 的DNA
[α-32P]-dNTP 其他3 种dNTP
变性
35 ′′
3 ′末端标记的 DNA
3 ′ 32P-末端标记的
5′
单链DNA探针
21
标记探针的纯化
Luminol化学发光原理
1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；
2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。
思考题：
2020年3月4日1时8分
29
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• 基因组结构分析： 如缺失、插入、倒位等的检测 • RFLP连锁分析
Northern blotting:
• 检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估 计）；
• mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪， 定量分析）

（一）、Southern Blot
• 原理：
将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后， 通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并 按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼 龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与 探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进 行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的 技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对 大小。
Southern Blot 操作步骤：
DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色
（二）Northern Blot
• 原理：在变性条件下将待检的RNA
样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照 同Southern Blot相同的原理进行转膜 和用探针进行杂交检测。
操作过程
mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光
（三）探针标记技术
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标
标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸， 与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否 有同源的核酸分子存在。
• 1 标记物：放射性和非放射性两种
Weak signal!!
Trouble shooting-2
Trouble shooting-2
Problems
Weak signal
Possible causes and solutions
2.1) Transfer efficiency may have been poor. 2.2) Insufficient protein was loaded on to the gel. 2.3) The concentration of primary and secondary antibodies could be too low; optimization is required. 2.4) Film exposure time may have been too short.
B.点印迹, 狭缝印迹 (Dot blotting & Slot blotting )
C.原位杂交 (In situ hybridization )
• DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
• RNA印迹技术 (Northern blotting)
效果好
1.5%BSA（小牛血 效果好 清白蛋白）
HRP（辣根过氮化物酶）效果好， 背景低，经济划算但不适合生物素 标记反应 适合碱性磷酸酶和生物素标记检测
使用范围比较广，但较浪费
抗体的选择
原供货商
产品特 点
主要代理商
Sigma-Aldrich Co.
Merck Biosciences
Zymed Laboratories
晶美生物工程公司济南代 表处
Lab Vision & NEOMARKERS
抗体种类全，稀释比例低，产 品质量不稳定，但价格较同类 产品最低。
晶美生物工程公司济南代 表处
内参的选择
•Western Blot为什么必须要用内参： •要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的 蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞、等量 的上样量，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样 量的差别就很可能影响结果的分析。 •常用的蛋白质内参有：GAPDH（glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin 或beta-tubulin。
该方法使用时应注意：
A.只能标记双链DNA，使用探针时要预先变性后再使用，而 且标记时DNA片段不太小；
B. DNA酶I使用的量要合适，太多会将DNA模板切碎，不能 进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能 进入缺口；
C. 标记时间不能太短，太短时间会造成标记量不足，影响 杂交的进行。
随机引物合成法
• 用一些随机引物和探针DNA片段一起加热变性， 退火后，引物与单链DNA互补结合，再在大肠 杆菌聚合酶I的作用下，按碱基互补配对的原则 不断在其3’端添加标记的单核苷酸修补缺口， 合成新的探针片段。
随机引物法是近几年来兴起的一种有效的标记方法，可与 PCR技术方法结合进行引物的标记。此法对于较小的DNA片 段也能很好地进行标记，一般对基因组DNA进行标记时用 这种方法的效果较好。
主要仪器选择
•Bio-Rad经典Mini系列： Mini-PROTEAN 3 Mini Trans-Blot •电泳世家Hoefer： Hofer MiniVE •国产品牌－北京市六一仪器厂： DYCZ-24D型电泳槽 DYCZ-40D型转移槽
主要试剂
(1) 30%丙烯酰胺（Acr/Bis）过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。
(2) 10%SDS (3) 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 (4) 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液： (5) 0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液： (6) 10%过硫酸铵(AP) (7) TEMED（四甲基乙二胺） (8) 样品溶解液 (9) 固定液、染色液和脱色液 (10)电极缓冲液 (11) 转印缓冲液 (12)检测系统－显色系统 (13)显影系统
除此之外，该方法有如下一些优点：
A.模板的纯度不是很高也可以进行标记；
B.反应比较稳定，可通过延长反应时间来增加探针产量；
C.标记的探针活性高，易于杂交的检测；
D.该方法可以在低熔点琼糖中进行，易于回收探针。
三、蛋白分子杂交
1.原则和应用
•一抗与待检测蛋白根据抗原－抗体结合原理结合，再与 抗一抗的、带有HRP等标记的二抗结合； •根据酶促反应原理催化底物产生颜色反应； •蛋白分子杂交的目的就是运用特异的抗体或定量鉴定靶 蛋白的表达情况和与其相互作用的因子。
Excessive diffuse signal!!
Trouble shooting-3
Trouble shooting-3
切口平移法
• 原理：DNA酶I在Mg2+离子存在时，能在双链DNA的各股单 链的不同位置上造成随机切口，然后在存在着一种已标记 DNTP底物（如Dig-dUTP）的体系中用大肠杆菌聚合酶I进 行5’→3’修复合成，在这个反应过程中将已标记的DNTP 合成进DNA链中。
切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一 般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。
注：近年来使用生物素、地高辛作为控针，此二 者是半抗原，可以用其抗体进行免疫测定；罗丹 明类的荧光素可被紫外线激发荧光进行检测，已 有少量应用细胞原位杂交。
3.探针标记方法
• 放射性标记有体内标记法及体外标记法 。 • 体外标记法不需要活体生物，所得探针放射性较高。
故一般用体外标记法。体外标记法有两种：化学法和 酶法。 • 化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种 基团发生化学反应而进行标记，标记物直接与核酸分 子相连。 • 酶法是先将标记物标记在核苷酸上，然后再通过酶促 聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生 核酸探针。常用的有切口平移法、随机引物法、未端 标记法。
• 放射性：32P、35S和3H • 非放射性：生物素、地高辛素、荧光素
2. 探针的种类：
天然来源：DNA、Cdna、mRNA
人工合成：人工寡核苷酸探针可以由核酸自动合 成仪人工合成。如果已知DNA和RNA顺序，可选 出独特的区段（最好在20bp以上）和该区段的互 补碱基顺序、由仪器合成。探针长度以10—— 50bp，碱基对G：C含量为40——60%为好。
用于RNA的定性定量分析。
• 蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
三种主要分子杂交方法比较
Blotting
Southern Northern
Western
Sample
DNA
RNA
Protein
Hybridization DNA-DNA RNA-DNA Protein-Protein
抗体质量高，稀释比例大，存 放活性高。产品可靠，售后服 务好，但价格较贵。
抗体质量较高，稀释比例中， 存放活性高，产品可靠，售后 服务好，价格较sigma低，有抗 体小包装，比较经济。
抗体质量尚可，种类较全。价 格较适中。
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图示: A-G分别表示不同实验小鼠心脏蛋白，检测心脏组织匀浆中 Akt水平
显色系统
GE公司的advance ECL detection system
X 光片压片盒
关于ECL显色系统
显影系统
Good result!!
好的结果：背景干净，蛋白条带整齐、清晰而锐利，无杂 带，目的蛋白差别明显。
No signal!!
molecule
(Ag-Ab)
二、核酸分子杂交
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在 一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有 一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
分子杂交相关技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology