pKD4大肠杆菌表达载体说明

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大肠杆菌表达操作规程

大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。

2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。

3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。

4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。

5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。

二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。

培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。

2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。

3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。

4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。

5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。

6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。

7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。

8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。

9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。

三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。

2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。

3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。

4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。

大肠杆菌表达系统详细表格

最佳启动子具备的条件第一必须是强启动子能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的1030以上第二这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件第三这种启动子应是诱导型的能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导
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T7表达系统
大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7 噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。
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启动子
核糖体结合位点复制起点
转录终止子
6
常用的大肠杆菌表达载体
1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体
7
Lac启动子的表达载体
lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。
3
2>. 转录终止子
启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。
转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。

chapter 04 表达载体

②外源基因的表达水平与细胞中基因的拷贝数有关，拷贝数对于瞬时表达系统尤为重要。为此，可考虑将载体构建为一种自主复制型载体。
该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素β、干扰素γ 、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。
COS细胞
它来源于非洲绿猴肾细胞系，能组成性表达SV40的大T 抗原。
COS细胞的特点： ①细胞来源丰富；
②细胞易于培养和转染；
启动子和增强子
长为100～200bp，位于转录起始位点上游，一般由核心启动子和上游启动子两部分组成。
目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒，如SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。
病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。
常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一段长为237bp的 BamH I-Bcl I限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加poly(A)信号。
剪接信号
mRNA剪接所必需的最短序列位于内含子5 ′和3 ′边界上。在构建真核表达载体时都组入一个SV40的内含子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。 GT-AG法则
鼠骨髓瘤细胞的特点：
①细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养； ②能进行分泌表达，且表达量高； ③能对蛋白质进行糖基化修饰。
提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略
（1）设法提高外源基因的表达水平和产量
方法包括：
①载体启动子的强度和宿主范围，是外源基因高表达的关键因素之一，选择强启动子可获得高效表达。

pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-22b(+)编号载体名称北京华越洋生物VECT5200 pET-‐22b(+)pet22b载体基本信息别名: pET22b, p et 22b, p ET-‐22b(+)质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5500bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG-‐3'载体标签: N-‐pelB; C-‐His载体抗性: 氨苄备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。

稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息pet22b载体简介pET-‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。

载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。

注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。

T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。

质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。

pet22b载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG661 CATAAGGGAG AGCGTCGAGA TCCCGGACAC CATCGAATGG CGCAAAACCT TTCGCGGTAT 721 GGCATGATAG CGCCCGGAAG AGAGTCAATT CAGGGTGGTG AATGTGAAAC CAGTAACGTT 781 ATACGATGTC GCAGAGTATG CCGGTGTCTC TTATCAGACC GTTTCCCGCG TGGTGAACCA 841 GGCCAGCCAC GTTTCTGCGA AAACGCGGGA AAAAGTGGAA GCGGCGATGG CGGAGCTGAA 901 TTACATTCCC AACCGCGTGG CACAACAACT GGCGGGCAAA CAGTCGTTGC TGATTGGCGT 961 TGCCACCTCC AGTCTGGCCC TGCACGCGCC GTCGCAAATT GTCGCGGCGA TTAAATCTCG 1021 CGCCGATCAA CTGGGTGCCA GCGTGGTGGT GTCGATGGTA GAACGAAGCG GCGTCGAAGC 1081 CTGTAAAGCG GCGGTGCACA ATCTTCTCGC GCAACGCGTC AGTGGGCTGA TCATTAACTA 1141 TCCGCTGGAT GACCAGGATG CCATTGCTGT GGAAGCTGCC TGCACTAATG TTCCGGCGTT 1201 ATTTCTTGAT GTCTCTGACC AGACACCCAT CAACAGTATT ATTTTCTCCC ATGAAGACGG 1261 TACGCGACTG GGCGTGGAGC ATCTGGTCGC ATTGGGTCAC CAGCAAATCG CGCTGTTAGC 1321 GGGCCCATTA AGTTCTGTCT CGGCGCGTCT GCGTCTGGCT GGCTGGCATA AATATCTCAC 1381 TCGCAATCAA ATTCAGCCGA TAGCGGAACG GGAAGGCGAC TGGAGTGCCA TGTCCGGTTT 1441 TCAACAAACC ATGCAAATGC TGAATGAGGG CATCGTTCCC ACTGCGATGC TGGTTGCCAA 1501 CGATCAGATG GCGCTGGGCG CAATGCGCGC CATTACCGAG TCCGGGCTGC GCGTTGGTGC 1561 GGATATCTCG GTAGTGGGAT ACGACGATAC CGAAGACAGC TCATGTTATA TCCCGCCGTT 1621 AACCACCATC AAACAGGATT TTCGCCTGCT GGGGCAAACC AGCGTGGACC GCTTGCTGCA 1681 ACTCTCTCAG 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ACCCTCACAA CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA 2581 TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT 2641 ACACGGAGGC ATCAGTGACC AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA 2701 GAAGCCAGAC ATTAACGCTT CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG 2761 ACATCTGTGA ATCGCTTCAC GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT 2821 TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC 2881 TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT 2941 GTCGGGGCGC AGCCATGACC CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA 3001 TGCGGCATCA GAGCAGATTG TACTGAGAGT GCACCATATA TGCGGTGTGA AATACCGCAC 3061 AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 3121 CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 3181 TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG CCAGCAAAAG 3241 GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG CCCCCCTGAC3301 GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG ACTATAAAGA 3361 TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC CCTGCCGCTT 3421 ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA TAGCTCACGC 3481 TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT GCACGAACCC 3541 CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC CAACCCGGTA 3601 AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG AGCGAGGTAT 3661 GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC TAGAAGGACA 3721 GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT TGGTAGCTCT 3781 TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 3841 ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG GTCTGACGCT 3901 CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA AAGGATCTTC 3961 ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT ATATGAGTAA 4021 ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC GATCTGTCTA 4081 TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT ACGGGAGGGC 4141 TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC GGCTCCAGAT 4201 TTATCAGCAA 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pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。

大肠杆菌的原核表达实验过程结果

大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。

2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。

可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。

3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。

4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。

5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。

6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。

在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。

pBad gIII C大肠杆菌表达载体说明

pBad/gIII C编号名称北京华越洋VECT-‐430 pBad/gIII CpBadgIII C载体基本信息载体名称: pBad/gIII C， pBadgIII C, p BadgIIIC. p Bad/gIIIC 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高启动子: araBad克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4149 b p5' 测序引物及序列: pBAD-‐F: A TGCCATAGCATTTTTATCC3' 测序引物及序列: pBAD-‐R: g atttaatctgtatcagg载体标签: N-‐GIII s ignal, C-‐His, C-‐Myc载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pBadgIII C载体质粒图谱和多克隆位点信息pBadgIII C载体简介pBAD/gIII载体质粒是衍生于pBR322载体。

载体设计用来在大肠杆菌中进行可调节分泌性表达和纯化重组目的蛋白。

使用基因III信号序列来定位重组蛋白，使其分泌到大肠杆菌周质腔中。

使用大肠杆菌araBAD启动子（pBAD）增强了大肠杆菌重组蛋白可溶性表达的水平。

载体上的调节蛋白AraC能够调控pBad启动子。

pBadgIII C载体序列 AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCA AACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACA AAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAG CATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACC CGTTTTTTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTC TATAGCCATAGCACCATGGCGGCCGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA ACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAAC GGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGA AGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCA GAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCA AATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCT GAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACG CCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACA AACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATG CTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGT TTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAG CAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTT ACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTA CTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGC CTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCA ATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGAT AAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGT ATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGT GCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTT CATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAG TTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC GTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAG TTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCT GCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGG TCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTA CAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGG GTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTT CGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGC AACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCT GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGC AGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATT TCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGC TATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTT GTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCAC CGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCT GTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTA CCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGG CCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGG CGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGA CGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGC TGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCA TCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCA GCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCT GGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGT AGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAA TCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCC CCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGAT AACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGAT CATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAG其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyan pDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPO pBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His C pBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+) pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐His pRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5xpTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+) PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII ApET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis BpET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3XpGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99apET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KGpGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。

pET-21a(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-21a(+)编号载体名称北京华越洋生物VECT4170 pET-‐21a(+)pET21a载体基本信息别名: pET21a, p et 21a质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达表达水平: 高克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 5443bp5' 测序引物: T75' 测序引物序列: 5'-‐TAATACGACTCACTATAGGG-‐3'载体标签: N-‐T7, C-‐His载体抗性: Ampicillin备注: Same a s p ET24abcd(+) b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS; T he f1 o riginis o riented s o t hat i nfection w ith h elper p hage w ill p roduce v irionscontaining single-‐stranded DNA that corresponds to the codingstrand.稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 组成型 Constitutive病毒/非病毒: 非病毒pET21a载体质粒图谱和多克隆位点信息pET21a载体简介The pET-‐21a-‐d(+) vectors carry an N-‐terminal T7•Tag® sequence plus an optional C-‐terminal His•Tag® sequence. These vectors differ from pET-‐24a-‐d(+) only by their selectable marker (ampicillin vs. kanamycin resistance). Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed o n t he circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNApolymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage willproduce virions containing single-‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, s ingle-‐stranded s equencing s hould b e p erformed u sing t he T7 t erminator p rimer.pET21a载体序列ORIGIN1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGCGACCC ATTTGCTGTC CACCAGTCAT GCTAGCCATA241 TGTATATCTC CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC301 ACAATTCCCC TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC361 CGGACGCATC GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC421 CGACATCACC GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG481 CGTGGGTATG GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC541 ACCATTCCTT GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT601 GCAGGAGTCG CATAAGGGAG AGCGTCGAGA TCCCGGACAC CATCGAATGG CGCAAAACCT661 TTCGCGGTAT GGCATGATAG CGCCCGGAAG AGAGTCAATT CAGGGTGGTG AATGTGAAAC721 CAGTAACGTT ATACGATGTC GCAGAGTATG CCGGTGTCTC TTATCAGACC GTTTCCCGCG781 TGGTGAACCA GGCCAGCCAC GTTTCTGCGA AAACGCGGGA AAAAGTGGAA GCGGCGATGG841 CGGAGCTGAA TTACATTCCC AACCGCGTGG CACAACAACT GGCGGGCAAA CAGTCGTTGC901 TGATTGGCGT TGCCACCTCC AGTCTGGCCC TGCACGCGCC GTCGCAAATT GTCGCGGCGA961 TTAAATCTCG CGCCGATCAA CTGGGTGCCA GCGTGGTGGT GTCGATGGTA GAACGAAGCG1021 GCGTCGAAGC CTGTAAAGCG GCGGTGCACA ATCTTCTCGC GCAACGCGTC AGTGGGCTGA1081 TCATTAACTA TCCGCTGGAT GACCAGGATG CCATTGCTGT GGAAGCTGCC TGCACTAATG1141 TTCCGGCGTT ATTTCTTGAT GTCTCTGACC AGACACCCAT CAACAGTATT ATTTTCTCCC1201 ATGAAGACGG TACGCGACTG GGCGTGGAGC ATCTGGTCGC ATTGGGTCAC CAGCAAATCG1261 CGCTGTTAGC GGGCCCATTA AGTTCTGTCT CGGCGCGTCT GCGTCTGGCT GGCTGGCATA1321 AATATCTCAC TCGCAATCAA ATTCAGCCGA TAGCGGAACG GGAAGGCGAC TGGAGTGCCA1381 TGTCCGGTTT TCAACAAACC ATGCAAATGC TGAATGAGGG CATCGTTCCC ACTGCGATGC1441 TGGTTGCCAA CGATCAGATG GCGCTGGGCG CAATGCGCGC CATTACCGAG TCCGGGCTGC1501 GCGTTGGTGC GGATATCTCG GTAGTGGGAT ACGACGATAC CGAAGACAGC TCATGTTATA1561 TCCCGCCGTT AACCACCATC AAACAGGATT TTCGCCTGCT GGGGCAAACC AGCGTGGACC1621 GCTTGCTGCA ACTCTCTCAG GGCCAGGCGG TGAAGGGCAA TCAGCTGTTG CCCGTCTCAC1681 TGGTGAAAAG AAAAACCACC CTGGCGCCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG1741 CCGATTCATT AATGCAGCTG GCACGACAGG TTTCCCGACT GGAAAGCGGG CAGTGAGCGC1801 AACGCAATTA ATGTAAGTTA GCTCACTCAT TAGGCACCGG GATCTCGACC GATGCCCTTG1861 AGAGCCTTCA ACCCAGTCAG CTCCTTCCGG TGGGCGCGGG GCATGACTAT CGTCGCCGCA1921 CTTATGACTG TCTTCTTTAT CATGCAACTC GTAGGACAGG TGCCGGCAGC GCTCTGGGTC1981 ATTTTCGGCG AGGACCGCTT TCGCTGGAGC GCGACGATGA TCGGCCTGTC GCTTGCGGTA2041 TTCGGAATCT TGCACGCCCT CGCTCAAGCC TTCGTCACTG GTCCCGCCAC CAAACGTTTC2101 GGCGAGAAGC AGGCCATTAT CGCCGGCATG GCGGCCCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC2161 CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA2221 CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA2281 ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC2341 TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT 2401 ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC 2461 ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA 2521 GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA 2581 AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC 2641 CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT 2701 GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC 2761 CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC 2821 ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT 2881 GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT 2941 GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG TACTGAGAGT GCACCATATA TGCGGTGTGA 3001 AATACCGCAC AGATGCGTAA GGAGAAAATA CCGCATCAGG CGCTCTTCCG CTTCCTCGCT 3061 CACTGACTCG CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC 3121 GGTAATACGG TTATCCACAG AATCAGGGGA TAACGCAGGA AAGAACATGT GAGCAAAAGG 3181 CCAGCAAAAG GCCAGGAACC GTAAAAAGGC CGCGTTGCTG GCGTTTTTCC ATAGGCTCCG 3241 CCCCCCTGAC GAGCATCACA AAAATCGACG CTCAAGTCAG AGGTGGCGAA ACCCGACAGG 3301 ACTATAAAGA TACCAGGCGT TTCCCCCTGG AAGCTCCCTC GTGCGCTCTC CTGTTCCGAC 3361 CCTGCCGCTT ACCGGATACC TGTCCGCCTT TCTCCCTTCG GGAAGCGTGG CGCTTTCTCA 3421 TAGCTCACGC TGTAGGTATC TCAGTTCGGT GTAGGTCGTT CGCTCCAAGC TGGGCTGTGT 3481 GCACGAACCC CCCGTTCAGC CCGACCGCTG CGCCTTATCC GGTAACTATC GTCTTGAGTC 3541 CAACCCGGTA AGACACGACT TATCGCCACT GGCAGCAGCC ACTGGTAACA GGATTAGCAG 3601 AGCGAGGTAT GTAGGCGGTG CTACAGAGTT CTTGAAGTGG TGGCCTAACT ACGGCTACAC 3661 TAGAAGGACA GTATTTGGTA TCTGCGCTCT GCTGAAGCCA GTTACCTTCG GAAAAAGAGT 3721 TGGTAGCTCT TGATCCGGCA AACAAACCAC CGCTGGTAGC GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA 3781 GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC TCAAGAAGAT CCTTTGATCT TTTCTACGGG 3841 GTCTGACGCT CAGTGGAACG AAAACTCACG TTAAGGGATT TTGGTCATGA GATTATCAAA 3901 AAGGATCTTC ACCTAGATCC TTTTAAATTA AAAATGAAGT TTTAAATCAA TCTAAAGTAT 3961 ATATGAGTAA ACTTGGTCTG ACAGTTACCA ATGCTTAATC AGTGAGGCAC CTATCTCAGC 4021 GATCTGTCTA TTTCGTTCAT CCATAGTTGC CTGACTCCCC GTCGTGTAGA TAACTACGAT 4081 ACGGGAGGGC TTACCATCTG GCCCCAGTGC TGCAATGATA CCGCGAGACC CACGCTCACC 4141 GGCTCCAGAT TTATCAGCAA TAAACCAGCC AGCCGGAAGG GCCGAGCGCA GAAGTGGTCC 4201 TGCAACTTTA TCCGCCTCCA TCCAGTCTAT TAATTGTTGC CGGGAAGCTA GAGTAAGTAG 4261 TTCGCCAGTT AATAGTTTGC GCAACGTTGT TGCCATTGCT GCAGGCATCG TGGTGTCACG 4321 CTCGTCGTTT GGTATGGCTT CATTCAGCTC CGGTTCCCAA CGATCAAGGC GAGTTACATG 4381 ATCCCCCATG TTGTGCAAAA AAGCGGTTAG CTCCTTCGGT CCTCCGATCG TTGTCAGAAG 4441 TAAGTTGGCC GCAGTGTTAT CACTCATGGT TATGGCAGCA CTGCATAATT CTCTTACTGT 4501 CATGCCATCC GTAAGATGCT TTTCTGTGAC TGGTGAGTAC TCAACCAAGT CATTCTGAGA 4561 ATAGTGTATG CGGCGACCGA GTTGCTCTTG CCCGGCGTCA ATACGGGATA ATACCGCGCC 4621 ACATAGCAGA ACTTTAAAAG TGCTCATCAT TGGAAAACGT TCTTCGGGGC GAAAACTCTC 4681 AAGGATCTTA CCGCTGTTGA GATCCAGTTC GATGTAACCC ACTCGTGCAC CCAACTGATC 4741 TTCAGCATCT TTTACTTTCA CCAGCGTTTC TGGGTGAGCA AAAACAGGAA GGCAAAATGC 4801 CGCAAAAAAG GGAATAAGGG CGACACGGAA ATGTTGAATA CTCATACTCT TCCTTTTTCA 4861 ATATTATTGA AGCATTTATC AGGGTTATTG TCTCATGAGC GGATACATAT TTGAATGTAT 4921 TTAGAAAAAT AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGAAAT4981 TGTAAACGTT AATATTTTGT TAAAATTCGC GTTAAATTTT TGTTAAATCA GCTCATTTTT 5041 TAACCAATAG GCCGAAATCG GCAAAATCCC TTATAAATCA AAAGAATAGA CCGAGATAGG 5101 GTTGAGTGTT GTTCCAGTTT GGAACAAGAG TCCACTATTA AAGAACGTGG ACTCCAACGT 5161 CAAAGGGCGA AAAACCGTCT ATCAGGGCGA TGGCCCACTA CGTGAACCAT CACCCTAATC 5221 AAGTTTTTTG GGGTCGAGGT GCCGTAAAGC ACTAAATCGG AACCCTAAAG GGAGCCCCCG 5281 ATTTAGAGCT TGACGGGGAA AGCCGGCGAA CGTGGCGAGA AAGGAAGGGA AGAAAGCGAA 5341 AGGAGCGGGC GCTAGGGCGC TGGCAAGTGT AGCGGTCACG CTGCGCGTAA CCACCACACC 5401 CGCCGCGCTT AATGCGCCGC TACAGGGCGC GTCCCATTCG CCA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyan pDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMO pCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPO pBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His C pBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+) pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+)pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+)pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+)pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+)pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。

原核大肠杆菌蛋白表达

原核大肠杆菌蛋白表达系统是一种常用的表达系统，它基于细菌细胞（通常为大肠杆菌）对外源基因的转录和翻译过程。

在表达载体中，包含有启动子、激活子和选择子等元件，这些元件使得外源基因能够被细菌细胞识别、转录成mRNA，并通过翻译过程合成目标蛋白。

大肠杆菌表达载体的要求如下：
1. 操纵子以及相应的调控序列，因为外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用。

2. SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7\~13bp翻译效率最高。

3. 多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。

此外，目的基因在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因。

原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因含有内含子不能直接表达，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。

同时还需要提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。

以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。

大肠杆菌表达系统使用指导

胞因子与细胞因子受体基因重组，可大大促进其生物学活性的发挥。IL- 6在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL-6和IL6Rα(gp80)的结合使其易于和另一个受体IL-6Rβ (gpl30)结合。
第8页/共24页
体系选择
研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞
多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织
• HSA是包含585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质，分子量65kD。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质 (达40g/L)，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重要生物物质的作用。HSA本身是许多内源因子和外源药物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度，增加在体内的半衰期至19d之久。
第11页/共24页
各种融合蛋白表达载体
• Protein A • GST（glutathione S-transferase） • CBD (chitin-binding domain, BioLabs;
cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) • MBP (maltose-binding protein) • GFP (green fluorescence protein) • Thioredoxin **帮助二硫键形成 • Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 • SUMO (small ubiquitin-related modifier) • KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀可用亲和层析纯化帮助可溶化帮助分泌到周质

大肠杆菌表达系统的研究进展综述

基因工程制药综述班级：生技132XX：学号：大肠杆菌表达系统的研究进展综述自上世纪70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。

尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。

尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白构造以及功能研究的开展,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。

文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。

1 表达载体1. 1 表达调控构建有效的表达载体是表达目的基因的根本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。

标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。

理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达,然而目的基因在宿主体内过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反响, 影响蛋白的活性等。

基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。

现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择适宜的启动子或合理开发新的载体系统。

譬如Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降, 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。

目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。

别离具有适宜强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。

大肠杆菌表达

大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。

大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。

本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。

大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。

表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。

启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。

参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。

大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。

2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。

3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。

4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。

5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。

6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。

大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。

2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。

3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。

4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。

总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。

大肠杆菌_枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建_刘成君

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pBV220大肠杆菌表达载体说明

pBV220编号名称北京华越洋VECT-‐110 pBV220pBV220载体基本信息载体名称: pBV220质粒类型: 原核表达载体，温控型表达载体，热诱导表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: pR/pL克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 3666 b p5' 测序引物及序列: pBV220-‐F: 5ʹ′-‐AAGAAGGGCAGCATTCAAAG-‐3‘3' 测序引物及序列: pBV220-‐R: 5ʹ′-‐CTGCGTTCTGATTTAATCTG-‐3‘载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄筛选标记: -‐-‐备注: pBV220质粒的SD sequence（用于结合原核生物核糖体的序列）后紧跟多克隆酶切位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白。

载体含有强的转录终止子可防止出现"通读"现象，有利于质粒-‐宿主系统的稳定。

载体pBV220为3.7Kb，有利于增加其拷贝数及容量。

pBV220含有PL启动子和编码对该启动子具有抑制作用而又对温度敏感的cI蛋白基因cIts857调控基因cI，因此可用温度对插入其中的外源基因的转录进行调控。

温控型原核表达载体，高拷贝数，大容量，强启动子，强转录终止子，可在任何受体菌中诱导表达。

pBV220载体是λPL/PR-‐cI857温度敏感系统表达载体，能够在42 表达非融合的目的蛋白。

在利用pBV220载体进行质粒构建的时候，需要加入ATG起始密码子。

PBV220质粒属于温度诱导表达型，培养温度为30 ，诱导温度为42 。

稳定性: 诱导表达组成型: 非组成型病毒/非病毒: 非病毒pBV220载体质粒图谱和多克隆位点信息Ampr, 氨苄抗性基因;ori, 质粒复制起点;cIts857, lambda 噬菌体表达抑制基因，但是在热诱导条件下能够表达目的基因; PRPL, 来自于lambda 噬菌体的串联的PR和PL启动子，保证基因的高水平表达; SD, Shine-Dalgarno序列;rrnB, 核糖体rrnB基因，是基因转录终止信号;pBV220载体简介pBV220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体,目前仍在广泛使用.pBV220载体序列ORIGIN1 GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTTCTGT TTTGGCTTAT GAGAGAAGAT 61 TTTCAGCCTG ATACAGATTA AATCAGAACG CAGAAGCGGT CTGATAAAAC AGAATTTGCC 121 TCCCGGCAGT AGCGCGGTGG TCCCACCTGA CCCCATGCCG AACTCAGAAG TGAAACGCCG 181 TAGCGCCGAT GGTAGTGTGG GGTCTCCCCA TGCGAGAGTA GCCAACTGCC AGGCATCAAA 241 TAAAACGAAA GGCTCAGTCG AAAGACTGGG CCTTTCGTTT TATCTGTTGT TTGTCGGTGA 301 ACGCTCTCCT GAGTAGGACA AATCCGCCGG GAGCGGATTT GAACGTTGCG AAGCAACGGC 361 CCGGAGGGTG GCGGGCAGGA CGCCCGCCAT AAACTGCCAG GCATCAAAGG AATCAGAAGG 421 CCATCCTGAC GGATGGCCTT TTTGCGTTTC TACAAACTCT TTGTTTATTT TTCTAAATAC 481 ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA 541 AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT 601 TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 661 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA 721 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG 781 CGGTATTATC CCGTGTTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC 841 AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 901 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 961 TGACAACGAT CGGGAGGACC GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT 1021 GTAACTCGCC TTGATCGTTG GGAACCGGAT CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT 1081 GACACCACGA TGCCTGTAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC TGGCGAACTA 1141 CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG AGGCGGATAA AGTTGCAGGA 1201 CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT 1261 GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC 1321 GTAGTTATCT ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT 1381 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTCATATATA 1441 CTTTAGATTG ATTTAAAACT 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TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA GTCAGTGAGC 2341 GAGGAAGCGG AAGAGCGCCC TTATCTTTCC CTTTATTTTT GCTGCGGTAA GTCGCATAAA 2401 AACCATTCTT其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyan pDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMO pCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPO pBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His C pBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His B pBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+) pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) 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简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体

简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体背景近年来，细菌对抗生素产生的耐药性给治疗感染性疾病带来了极大的挑战。

因此，利用生物技术研发新型抗菌药物成为了解决这一问题的重要途径之一。

人体内天然存在的抗菌肽具有广谱抗菌活性和低毒性的优点，成为了研究的热点之一。

其中，人β防御素4（hBD4）具有广谱杀菌性、对多种抗生素产生耐药的菌株敏感等优点，成为了抗菌肽研究领域的重要代表之一。

目的本研究旨在利用大肠杆菌作为表达载体，实现hBD4的融合表达，并制备其多克隆抗体。

方法重组质粒搭建在pET28a载体的N端引入6个组氨酸残基的His标签和一个TEV酶切位点，构建重组质粒pET28a-His-TEV-hBD4。

大肠杆菌表达重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中转化pET28a-His-TEV-hBD4重组质粒。

利用IPTG诱导表达，将重组蛋白在SDS-PAGE中检测。

纯化重组蛋白将大肠杆菌采用超声技术破裂后，离心收集上清液，以Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白。

纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳分离并在Western blot中进行检测。

制备hBD4多克隆抗体将纯化后的蛋白注射到小鼠体内，取血清制备hBD4的多克隆抗体。

结果重组蛋白表达在重组质粒pET28a-His-TEV-hBD4导入大肠杆菌BL21（DE3）后，经过IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测，证实蛋白的表达成功。

纯化重组蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了蛋白。

用Western blot检测结果显示，蛋白具有较高的纯度。

制备多克隆抗体通过注射、回收小鼠血清，以及经过亲和层析纯化的过程，成功制备出hBD4多克隆抗体。

结论本研究成功地利用大肠杆菌表达和纯化了hBD4重组蛋白，并通过制备多克隆抗体实现了对hBD4蛋白的检测。

这为后续抗菌肽的研究提供了实验基础和技术支持。

大肠杆菌蛋白表达策略表达系统与表达载体

大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。

本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。

大肠杆菌表达系统的选择与构建表达载体的选择根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG 诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。

根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。

融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。

常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。

其中His-Tag和GST-Tag 是目前使用最多的。

His Tag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。

His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。

目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。

除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。

它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。

此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。

大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用

大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。

利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。

本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。

一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。

选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。

2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。

3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。

可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。

4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。

通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。

二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。

这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。

2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。

通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。

3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。

通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。

4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。

将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。

5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。

通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。

大肠杆菌表达载体

pGEX-1T—凝血酶
pGEX-2T---凝血酶
pGEX-3T---X因子
位相载体
西南大学生物技术专业基因工程 14
分泌型融合表达载体----pEZZ18
西南大学生物技术专业基因工程
15
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
西南大学生物技术专业基因工程
16
四、表达产物的纯化
1 、包涵体 (inclusion body) 的纯化：许多情况下表达产物在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体，可通过机械法、冻融法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包涵体，洗涤去除杂蛋白，用盐酸胍、尿素和 SDS 溶解包涵体，再通过一定的法使蛋白质折叠。有的经上法得到后仍然有活性，有的蛋白一旦形成包涵体后就没有活性了，但可作为抗原。 2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内解物的上清部分用于纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液进行生化反应。
西南大学生物技术专业基因工程 7
3 、内含肽表达载体：如 NEB 公司的 Impact-Twin 系统，将目的蛋白放在两个可自裂解的内含肽 (intein)中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将标签蛋白切除。 4 、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。信号肽(signal peptide) 有碱性磷酸酶信号肽、蛋白质 A 信号肽（如 Amersham 公司的 pEZZ18 系统）。
西南大学生物技术专业基因工程
23
2 ）植物 Ac-Ds 转座子双因子插入突变：玉米 Ac (activator) 因子是一个转座子，含有完整的转座酶， Ds (dissociation) 是 Ac 缺失转座酶基因的缺失体，但具两端的反向重复序列。

大肠杆菌表达系统

影响因素包括：
（1）蛋白质的降解作用
在大肠杆菌的细胞中，含有大量的各种类型的蛋白酶，广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位，参与许多方面的代谢活动，包括选择性地酶解异常的蛋白质。
已知有许多因素，如不完全多肽、氨基酸取代突变、多酶复合体亚基的超量合成、氧化作用或游离自由基的作用而造成的翻译后损伤，以及基因工程技术的效应等，都可以导致蛋白质分子受损或构型变化，形成异常蛋白质。
* 使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。
到目前为止，这方面的技术还很不成熟，外泌率低。
2、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性
当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实现其功能表达时，我们往往会认为这是由于转录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究中就有许多实验表明，克隆的外源基因即便是在大肠杆菌中得到了表达，也并不一定就意味着它的多家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。
最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322 质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。
三、大肠杆菌的转化方法
1、Cohen转化法
第一节基因的表达系统与表达策略
最佳的基因表达体系：
⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。
宿主细胞的选择
适合目的基因表达的宿主细胞的要求:
1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。

pkd46质粒用法

pkd46质粒用法
质粒是一种小型的双链DNA分子，能够在细胞中独立存在并自我
复制。

pkd46质粒是一种常用的质粒，其中p代表质粒，kd代表由Kanamycin（卡那霉素）和Doxycycline（强力霉素）选择标记的质粒，46代表其分子量约为46 kb。

以下是pkd46质粒的一般用法：
1. 构建：根据需要，在质粒上进行DNA片段的克隆和整合，通常通过
限制性内切酶消化和连接酶连接适当的DNA片段。

2. 转化：将构建好的质粒转化到感受态的宿主细胞中，常见的宿主细
胞有大肠杆菌等。

3. 选择：通过添加抗生素（如卡那霉素）将转化后带有质粒的细菌筛
选出来，非转化的细菌将无法生长。

4. 扩增：在筛选出的带有pkd46质粒的细菌中培养液体培养基中，通
过培养并增殖大量细菌，进一步扩增质粒。

5. 提取：使用质粒提取试剂盒等方法从细菌中提取出质粒DNA。

6. 应用：质粒DNA可以用于进一步分析、测序、转录和翻译等实验操作，也可用于基因工程的研究和应用中。

需要注意的是，在使用pkd46质粒的过程中，建议参考相应的文
献或使用说明书，以确保正确操作和实验结果的准确性。

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pKD4编号名称北京华越洋VECT-‐510 pKD4pKD4载体基本信息载体名称: pKD4质粒类型: 细菌表达；基因敲除系统高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: -‐-‐克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 3267 b p5' 测序引物及序列: Amp-‐R: A TAATACCGCGCCACATAG C3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素（Ampicillin）筛选标记: 新霉素（Neomycin）备注: -‐-‐稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: -‐-‐pKD4载体质粒图谱和多克隆位点信息pKD4载体简介pKD4载体是RED系统敲除载体，复制子是R6K y o ri，质粒大小是3267bp，带有Ampicillin(Amp)和Kanamycin（Kan）抗性，可转化进大肠杆菌DH5α，通过抗生素抗性筛选大量复制扩增，培养条件是LB，30℃。

pKD4载体序列ORIGIN1 AGATTGCAGC ATTACACGTC TTGAGCGATT GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC GAAGTTCCTA 61 TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA GGAACTTCAA GATCCCCTCA CGCTGCCGCA 121 AGCACTCAGG GCGCAAGGGC TGCTAAAGGA AGCGGAACAC GTAGAAAGCC AGTCCGCAGA 181 AACGGTGCTG ACCCCGGATG AATGTCAGCT ACTGGGCTAT CTGGACAAGG GAAAACGCAA 241 GCGCAAAGAG AAAGCAGGTA GCTTGCAGTG GGCTTACATG GCGATAGCTA GACTGGGCGG 301 TTTTATGGAC AGCAAGCGAA CCGGAATTGC CAGCTGGGGC GCCCTCTGGT AAGGTTGGGA 361 AGCCCTGCAA AGTAAACTGG ATGGCTTTCT TGCCGCCAAG GATCTGATGG CGCAGGGGAT 421 CAAGATCTGA TCAAGAGACA GGATGAGGAT CGTTTCGCAT GATTGAACAA GATGGATTGC 481 ACGCAGGTTC TCCGGCCGCT TGGGTGGAGA GGCTATTCGG CTATGACTGG GCACAACAGA 541 CAATCGGCTG CTCTGATGCC GCCGTGTTCC GGCTGTCAGC GCAGGGGCGC CCGGTTCTTT 601 TTGTCAAGAC CGACCTGTCC GGTGCCCTGA ATGAACTGCA GGACGAGGCA GCGCGGCTAT 661 CGTGGCTGGC CACGACGGGC GTTCCTTGCG CAGCTGTGCT CGACGTTGTC ACTGAAGCGG 721 GAAGGGACTG GCTGCTATTG GGCGAAGTGC CGGGGCAGGA TCTCCTGTCA TCTCACCTTG 781 CTCCTGCCGA GAAAGTATCC ATCATGGCTG ATGCAATGCG GCGGCTGCAT ACGCTTGATC 841 CGGCTACCTG CCCATTCGAC CACCAAGCGA AACATCGCAT CGAGCGAGCA CGTACTCGGA 901 TGGAAGCCGG TCTTGTCGAT CAGGATGATC TGGACGAAGA GCATCAGGGG CTCGCGCCAG 961 CCGAACTGTT CGCCAGGCTC AAGGCGCGCA TGCCCGACGG CGAGGATCTC GTCGTGACCC 1021 ATGGCGATGC CTGCTTGCCG AATATCATGG TGGAAAATGG CCGCTTTTCT GGATTCATCG 1081 ACTGTGGCCG GCTGGGTGTG GCGGACCGCT ATCAGGACAT AGCGTTGGCT ACCCGTGATA 1141 TTGCTGAAGA GCTTGGCGGC GAATGGGCTG ACCGCTTCCT CGTGCTTTAC GGTATCGCCG 1201 CTCCCGATTC GCAGCGCATC GCCTTCTATC GCCTTCTTGA CGAGTTCTTC TGAGCGGGAC 1261 TCTGGGGTTC GAAATGACCG ACCAAGCGAC GCCCAACCTG CCATCACGAG ATTTCGATTC 1321 CACCGCCGCC TTCTATGAAA GGTTGGGCTT CGGAATCGTT TTCCGGGACG CCGGCTGGAT 1381 GATCCTCCAG CGCGGGGATC TCATGCTGGA GTTCTTCGCC CACCCCAGCT TCAAAAGCGC 1441 TCTGAAGTTC CTATACTTTC TAGAGAATAG GAACTTCGGA ATAGGAACTA AGGAGGATAT 1501 TCATATGGAC CATGGCTAAT TCCCATGTCA GCCGTTAAGT GTTCCTGTGT CACTGAAAAT 1561 TGCTTTGAGA GGCTCTAAGG GCTTCTCAGT GCGTTACATC CCTGGCTTGT TGTCCACAAC 1621 CGTTAAACCT TAAAAGCTTT AAAAGCCTTA TATATTCTTT TTTTTCTTAT AAAACTTAAA 1681 ACCTTAGAGG CTATTTAAGT TGCTGATTTA TATTAATTTT ATTGTTCAAA CATGAGAGCT 1741 TAGTACGTGA AACATGAGAG CTTAGTACGT TAGCCATGAG AGCTTAGTAC GTTAGCCATG 1801 AGGGTTTAGT TCGTTAAACA TGAGAGCTTA GTACGTTAAA CATGAGAGCT TAGTACGTGA 1861 AACATGAGAG CTTAGTACGT ACTATCAACA GGTTGAACTG CGGATCTTGC GGCCGCAAAA 1921 ATTAAAAATG AAGTTTTAAA TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT 1981 ACCAATGCTT AATCAGTGAG GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG 2041 TTGCCTGACT CCCCGTCGTG TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA 2101 GTGCTGCAAT GATACCGCGA GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC 2161 AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT2221 CTATTAATTG TTGCCGGGAA GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG 2281 TTGTTGCCAT TGCTACAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA 2341 GCTCCGGTTC CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG 2401 TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG TTATCACTCA 2461 TGGTTATGGC AGCACTGCAT AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG 2521 TGACTGGTGA GTACTCAACC AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT 2581 CTTGCCCGGC GTCAATACGG GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA 2641 TCATTGGAAA ACGTTCTTCG GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA 2701 GTTCGATGTA ACCCACTCGT GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG 2761 TTTCTGGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA AAAGGGAATA AGGGCGACAC 2821 GGAAATGTTG AATACTCATA CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT 2881 ATTGTCTCAT GAGCGGATAC ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC 2941 CGCGCACATT TCCCCGAAAA GTGCCACCTG CATCGATGGC CCCCCGATGG TAGTGTGGGG 3001 TCTCCCCATG CGAGAGTAGG GAACTGCCAG GCATCAAATA AAACGAAAGG CTCAGTCGAA 3061 AGACTGGGCC TTTCGTTTTA TCTGTTGTTT GTCGGTGAAC GCTCTCCTGA GTAGGACAAA 3121 TCCGCCGGGA GCGGATTTGA ACGTTGCGAA GCAACGGCCC GGAGGGTGGC GGGCAGGACG 3181 CCCGCCATAA ACTGCCAGGC ATCAAATTAA GCAGAAGGCC ATCCTGACGG ATGGCCTTTT 3241 TGCGTGGCCA GTGCCAAGCT TGCATGC//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-‐52b(+) pAmCyanpDsRed-‐Express2 pBV220 pCold-‐GST pColdS-‐SUMOpCold T F pCold I V pCold I II pCold I IpCold I pE-‐SUMO pCold-‐ProS2 pBAD102/D-‐TOPOpBAD202/D-‐TOPO pACYC184 pBAD/Thio-‐TOPO pBad/Myc-‐His CpBad/Myc-‐His B pBad/Myc-‐His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-‐TOPO pET-‐23b(+) pET-‐23a(+)pET-‐23c(+) pET-‐23(+) pET-‐12b(+) pET-‐12c(+)pET-‐12a(+) pET-‐11b(+) pET-‐11a(+) pET-‐11c(+)pBad24 pQE-‐82L pQE-‐81L pQE-‐80LpQE-‐32 pQE-‐9 pQE-‐16 pQE-‐31pQE-‐60 pQE-‐70 pQE-‐40 pET-‐51b(+)pET-‐50b(+) pET-‐49b(+) pET-‐48b(+) pET-‐47b(+)pET-‐26b(+) pET-‐32a(+) pET-‐21b(+) pET-‐22b(+)pET-‐14b pET-‐16b pET-‐15b pET-‐19bpET-‐20b(+) pET-‐21d(+) pET-‐21c(+) pET-‐21b(+)pET-‐21a(+) pET-‐24a(+) pET-‐24d(+) pET-‐25b(+)pET-‐27b(+) pET-‐28a(+) pET-‐30a(+) pET-‐42a(+)pET-‐43.1c(+) pET-‐43.1b(+) pET-‐43.1a(+) pET-‐44a(+)pET-‐44c(+) pET-‐46 E K/LIC pET-‐37b(+) pTrcHis2 CpTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-‐His pET302/NT-‐HispRSET-‐CFP pRSET-‐EmGFP pRSET-‐BFP pGFPuvpET300/NT-‐DEST pET301/CT-‐DEST pGEM-‐T pBad43pGEX-‐4T-‐3 pGEX-‐5X-‐2 pBlueScript S K(+) pG-‐Tf2pG-‐KJE8 pGro7 pET-‐SUMO pSE380pET-‐17b pET102/D-‐TOPO pCDFDuet-‐1 pMAL-‐p5x pTf16 pET-‐28c(+) pBluescript I I S K(+) pET-‐30b(+) pSUMO pProEX H Tc pProEX H Tb pProEX H Ta pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1 pTYB2 pTWIN2 pBluescript I I K S(-‐) pTYB12 pMAL-‐p5e pACYCDuet-‐1 pEGM-‐11ZF(+) pEGM-‐7ZF(+) PinPoint X a-‐3 PinPoint X a-‐2 PinPoint X a-‐1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-‐5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-‐5a(+) pMal-‐p4X pMal-‐p2G pkk223-‐3 pkk232-‐8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18 pMAL-‐c5x pMal-‐p2E pMal-‐p2X pET-‐44 E K/LIC pET-‐43.1 E K/LIC pET-‐41 E K/LIC pMal-‐c4X pTrcHis B pET-‐31b(+) pET-‐3b(+) pET-‐41a(+) pGEX-‐3X pGEX-‐4T-‐2 pETDuet-‐1 pGEX-‐4T-‐1 pTrc99a pET-‐28b(+) pET-‐His pALEX a,b,c pACYC177 pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10 pEcoli-‐6xHN-‐GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-‐KG pGEX-‐2T pRSFDuet-‐1 pCOLADuet-‐1 pTrcHis C pTrcHis A pET-‐41b(+) pET-‐42b(+) pET-‐3a(+) pGEX-‐6P-‐3 pGEX-‐6P-‐2 pGEX-‐6P-‐1 pGEX-‐5X-‐3 pGEX-‐5X-‐1 pGEX-‐2TK pRSET A pMal-‐c2G pMal-‐c2E pMal-‐c2X pRSET C pQE-‐30pET-‐45b(+) pET-‐44b(+) pET-‐42c(+) pET-‐41c(+) pET-‐40b(+) pET-‐33b(+) pET-‐39b(+) pET-‐32 E K/LIC pET-‐32 X a/LIC pET-‐32c(+) pET-‐32b(+) pET-‐30 X a/LIC pET-‐30 E K/LIC pET-‐30c(+) pET-‐29c(+) pET-‐29b(+) pET-‐29a(+) pET-‐24c(+) pET-‐24b(+) pET-‐24(+) pET-‐23d(+) pET-‐11d(+) pBad33。