液相色谱使用方法(花色苷)

引用格式：何金格，王　政，邓洁红. 高效液相色谱法测定蓝莓果中花色苷含量[J]. 湖南农业科学，2020（5）：68-71.　DOI:10.16498/ki.hnnykx.2020.005.019蓝莓（Blueberry）又称越橘、蓝浆果，杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（V accinium spp.）多年生落叶或常绿灌木，果实为浆果，近圆形，呈蓝色，酸甜适度，果肉细腻，皮薄籽小[1-2]。

蓝莓的花色苷（Anthocyanins）含量居于水果和蔬菜之首，被联合国粮农组织誉为“黄金浆果”[3]。

花色苷是黄酮类化合物，广泛存在于植物的根茎叶花果实等器官的细胞液中，使其呈现出红色蓝色或紫色等颜色，是自然界重要的水溶性的色素之一，分布于27个科，72个属的植物中[4]。

花色苷不仅赋予植物鲜艳的颜色以利于授粉和种子传播、抵抗植物虫害[4]以及预防植物的紫外线照射损伤[5]，而且具有重要的生物活性功能，如抗氧化活性、抗癌活性、抗动脉硬化活性[6]、降低血脂[7]、减少肝损伤[8]和降血糖活性[9]等。

花色苷属于天然的食用色素，且生理活性对人体具有重要的保健功能，得到国内外学者的广泛关注和研究，并且在食品、药品、保健品和化妆品等方面的应用十分广泛。

目前花色苷含量测定方面的研究比较多，主要是采用pH示差法测定总花色苷含量，而高效液相色谱法具有能够准确测量单一组分和将花色苷物质良好分离的优点。

林丽等[10]利用大孔树脂分离纯化，运用高效液相色谱法，快速准确地测定黑果枸杞提取物中的花色苷主要成分物质矮牵牛素-5-O-葡萄糖苷含量。

赵珊等[11]采用盐酸甲醇溶液超声提取有色稻米花色苷，以超高效液相色谱-紫外检测器对有色稻米中主要花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷进行定量检测。

笔者在前人研究[12-15] 的基础，以张家界引种的蓝莓品种为研究对象，重点研究高效液相色谱法测定蓝莓果中花色苷（以飞燕草素-3-O-葡萄糖苷计）的相对含量，以期对果实品质的评价和深加工等方面的研究提供数据参考，也为蓝莓果中花色苷单体的分离和制备提供一定的参考依据。

花色苷的提取及分析研究进展王化;周丽萍;于志民;吕品;张悦【摘要】花色苷是广泛存在于自然界植物中的一类黄酮类化合物,来源广泛、种类繁多且具有多种保健功能,具有较好的开发利用价值和应用前景,近年来一直是国内外研究的热点之一.文章综述了花色苷的结构及稳定性、提取和纯化以及分析方法的研究进展,旨在为进一步展开植物花色苷的研究提供参考.【期刊名称】《国土与自然资源研究》【年(卷),期】2018(000)006【总页数】4页(P85-88)【关键词】花色苷;稳定性;高速逆流色谱;离子迁移质谱【作者】王化;周丽萍;于志民;吕品;张悦【作者单位】黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室,哈尔滨150040;黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室,哈尔滨150040;黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室,哈尔滨150040;黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室,哈尔滨150040;黑龙江省科学院自然与生态研究所湿地与生态保育国家地方联合工程实验室,哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】Q946花色苷（Anthocyanin）一词是Marguart在1835年首先用来命名矢车菊花朵中的蓝色提取物时提出来的，现为同类物质的总称[1]。

大量研究表明，花色苷广泛存在于自然界中植物的细胞液中，使根、茎、花、叶、果实呈现蓝、紫红、红等不同颜色。

花色苷属黄酮类物质，具有较好的营养及药理作用，在医药、食品、化妆品等领域有很大应用潜力。

近年来，花色苷受到越来越多的关注，研究表明，花色苷能以糖苷的形式进入体内，具有抗氧化、抗肿瘤、保护视力、保护心血管、保护肝脏等多种生理功能[2，3]，采取适当的方法对花色苷结构进行深入研究可与其功能研究相辅相成，相得益彰。

本文主要根据近年来对花色苷化合物的研究，对国内外关于花色苷的结构及稳定性、提取和纯化以及分析方法的研究进展予以简要综述。

高效液相色谱法测定黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷方法
的建立
夏辉;刘旭;蒋国振;刘萍;姬玲霞
【期刊名称】《粮食与食品工业》
【年(卷),期】2024(31)1
【摘要】本试验建立一种高效液相色谱法测定黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量的方法。

结果表明:本方法可有效分离目标色谱峰。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在0.20~50.0μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系(R_(2)为0.999894),精密度RSD 为0.1%,重复性RSD为0.2%~1.3%,检出限和定量限分别为0.1 mg/kg、0.3 mg/kg。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷低、中、高浓度回收率分别为96.5%、98.4%、100.7%。

该方法线性良好,准确度和精密度高,重复性和回收率较好,适用于黑米花色苷矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的测定。

【总页数】5页(P68-72)
【作者】夏辉;刘旭;蒋国振;刘萍;姬玲霞
【作者单位】陕西省粮食质量安全中心
【正文语种】中文
【中图分类】TS201
【相关文献】
1.高效液相色谱法对黑米中花色苷成分的测定
2.高效液相色谱法测定阿萨伊冻干粉中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量
3.草莓中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定的方
法学研究4.黑米花色苷矢车菊素-3-O-β-葡萄糖苷对脂多糖诱导的人THP-1单核细胞炎症损伤的保护作用
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液相色谱法如何用于药物分析液相色谱操作规程液相色谱法（High Performance Liquid ChromatographyHPLC）又称“高压液相色谱”“高速液相色谱”“高分别度液相色谱”“近代柱色谱”等。

液相色谱是色谱法的一个紧要分支，以液体为流动相，接受高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分别后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

如今，该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中紧要的分别分析技术应用。

尤其是在药物分析领域，有着广泛的应用。

液相色谱在药物分析中的应用，紧要考虑试样的预处理和分析柱、检测器的选择。

在试样的预处理上，日前兴起的固相（微）萃取使得很多含量低的成分得到精制提纯，从而适于液相色谱的测定。

中药中有些紫外吸取，或无特征紫外吸取的成分，直接用液相色谱测定，其灵敏度和分别度都不尽人意，利用柱前或柱后衍生化法可使这些成分较地测定出来。

对于极性大、脂溶性差物质，在YWGCl8柱上不易保留，用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂，降低其极性，延长柱上的保留时间，取得较好的分别较果。

将液相色谱和质谱这两个强有力的分析技术在线连接在一起，经过三十年的进展已成为一项较为成熟的分析手段，但是它从形成伊始就存在着问题：从液相色谱流进质谱时，流动相的变化、溶剂的构成、高温高压离子化的问题制约着这种联用技术进展。

大气压离子化接口具有去除溶剂和离子化的双重功效，它的引入使得该技术在各个领域得到了广泛的应用。

电喷雾离子源是一种软电离技术，一般只生成（M H）和（M—H）—两种分子离子峰，选择性监测（mz）190的负分子离子峰，具有较高的灵敏度、精准度、专一性，充分了低浓度药物讨论的需求。

三维液相色谱法可以同步测定葛根素和阿魏酸两种指标。

通过试验证明：假如选择合适的柱温等色谱条件，乙醇作为反相液相色谱流动相，分析中药及中成药中有效成分，既安全又精准。

液相色谱操作规程一、引言液相色谱（Liquid Chromatography）是一种广泛应用的分离和分析技术。

本文旨在介绍液相色谱的操作规程，包括仪器准备、样品处理、色谱条件设置以及数据分析等方面。

二、仪器准备在进行液相色谱实验之前，需要对仪器进行准备和检查。

首先，确认色谱柱状态和可用性。

检查色谱柱的状态，如是否有裂缝、堵塞或损坏。

接下来，准备并确认流动相溶液的浓度和pH值，并校准流速控制器。

最后，确认检测器和记录仪的正常工作状态。

三、样品处理在样品处理前，需要根据需要选择适当的样品前处理方法，如稀释、提取或净化。

确保样品处理步骤不会影响分析结果。

此外，还需检查样品的浓度、pH 值、溶剂性质和溶解度等因素，并选择合适的内标物。

四、色谱条件设置1. 流动相选择：根据分析物的特性选择合适的流动相。

常用的流动相包括纯水、有机溶剂或它们的混合物。

2. 色谱柱选择：根据分析物的极性和分离要求选择合适的色谱柱。

常见的色谱柱包括反相色谱柱、离子交换色谱柱、尺寸排阻色谱柱等。

3. 柱温选择：根据需要选择合适的柱温。

柱温的改变可以改善分离效果和峰形。

4. 流速控制：根据柱的尺寸和类型，选择适当的流速控制。

一般情况下，流速应控制在合适的范围内，以获得较好的分离效果。

五、样品进样在样品进样前，需尽可能减少或消除进样时的空气泡对结果的影响。

确保样品进入进样器之前，样品的溶液均匀混合并排除气泡。

另外，注意根据样品特性设置适当的进样量，并保证进样操作的准确性。

六、数据分析待分离完成后，根据所使用的检测器记录色谱峰的面积或高度，并进行相对峰面积或高度的计算。

在进行数据分析时，注意排除干扰和背景噪声，并根据需要进行峰的识别和定性。

七、结果解释和汇报根据数据分析的结果，进行结果的解释和整理。

在解释结果时，考虑样品的浓度、相对保留时间、峰面积、高度等因素。

同时，遵循实验要求和规范，撰写实验报告或形成结果汇报。

八、实验操作注意事项1. 安全注意事项：操作过程中需要注意安全规范，如佩戴手套和安全眼镜，避免化学品直接接触皮肤或眼睛。

液相色谱操作规程一.开机按以下次序打开色谱仪各部分电源。

泵→检测器→计算机主机→显示器→打印机二. 打开色谱工作站软件用鼠标双击“色谱工作站”图标，然后输入密码“SAGE”，选OK。

然后选“Alltech-426”图标。

三．设定色谱分析条件1. 设定色谱泵流量按箭头输入所需的流速，按RUN/STOP键开始运行。

2. 设定检测器条件检测器自检通过后，调整到检测所需波长数。

按ZREO键回零四. 准备分析1. 配置流动相，按体积比配置所需的流动相。

混合均匀，过滤、在超声波清洗器中超声20分钟。

2.将过滤头放入流动相中，打开泵上的旁通阀，按PURG键，冲洗并用注射器抽取一定量的流动相，直到塑料管中无气泡为止。

再按一下则停止。

3.按“RUN/STOP”键，开泵。

五.进样分析1.在计算机上，选择蓝色的“RUN/SINGLE”图标，在数据文件名的左侧，将chrom\后的文件名改为你设定的名称，如SAM01.001，然后选择OK。

将进样阀扳到LOAD位置，用微量注射器抽取所需量微升的样品，注入到进样阀中，按检测器的调零键“ZERO”，然后将进样阀扳到INJECT位置，敲键盘上的空格键这时，色谱系统开始工作。

2.色谱图采集完毕，系统自动停止计时。

此时选择“Analyze”图标，对谱图进行计算，然后选择“Reports”图标，选择“面积％”，即可在屏幕上观察分析结果。

如需将分析结果打印出来，选择打印机图标，选择“打印报告P→选择“定制C”，打印机即开始打印分析结果。

3.分析下一个样品，重复1步和2步。

每个样品之间间隔5分钟左右。

六.关机关机前，用流动相冲洗色谱柱20~30分钟，如色谱柱长期不用，再用纯乙腈冲洗20~30分钟，然后，先关闭计算机软件，按以下次序切断各部分电源：计算机主机→显示器→泵→检测器注意事项：1. 计算机一定要先退出操作软件后，才能切断电源。

2. 色谱泵流量一般情况下不能超过1.5ml/min。

HPLC法测定果实中花色素苷含量上海农业2006,22(3):25—27ActaAgriculturaeShanghai文章编号:1000—3924(2006)03—25—03HPLC法测定果实中花色素苷含量骆军',张学英,李光平(上海市农业科学院林木果树研究所.上海201106;上海市农产品质量标准与检测技术研究所.上海201106)摘要:建立了果实中花色素苷的HPLC测定方法,采用ODS-C18柱(250nrn×4.6nrn),流动相A:1.6%甲酸水溶液;B:1.6%甲酸甲醇溶液,梯度洗脱为0～5min,85%A+15%B;5～10min,80%A+20%B;10～30min,72%A+28%B;30--36rain,40%A+60%B;36--48min,100%B.检测波长510lain,流速为1mL/n~.2种花色素苷在0.00104--0.0104rag/mE范围内线性良好,最低检出限为0.02mL,平均回收率为99.5%和99.25%,平均标准偏差为1.98%和2.50%,并测定了大石早生李和藤稔葡萄中花色素苷含量.关键词:HPLC;花色素苷;李;葡萄中图分类号:S662.3;S663.1文献标识码:A花色素苷是植物体内次生代谢物质,是苯丙氨酸代谢途径的产物,在细胞质和内质网膜内合成,再运输到液泡,呈现红色和紫色.水果中富含花色素苷,其种类和数量的多少使不同种或不同品种的果实表现出不同的颜色.花色素苷具有强抗氧化性,有抗癌,抗动脉硬化的作用,其对人体的保健作用越来越受到人们的重视.果实中花色素苷含量的多少不仅是影响果实外观色泽的重要因素,也是其保健价值高低的一个指标,因此,精确测定果实中花色素苷含量具有重要意义.1材料与方法1.1材料大石早生李(Prunussalicina)和藤稔葡萄(V.tiniferaL.×V.1abruscaL.)均采自上海市农业科学院果树试验园.试验仪器为Waters液相色谱,双波长检测器,色谱纯的矢车菊素一3一葡萄糖苷(Cyanin一3一glucoside),矢车菊素一3一芸香糖苷(Cyanin-3一rutinoside),2种标样均购自ApinChemicals公司.甲酸为分析纯,甲醇为色谱纯,水为0.22/_tm过滤的纯水.1.2方法从大石早生李和藤稔葡萄果实赤道部位取0.001800.2g果皮,液氮研磨,用30mL含1.6%甲酸的甲醇溶液在4℃下浸提过夜,超声波处理0?0013515min,用0.22m滤膜过滤后Waters液相色谱测定花色素苷含量.《.?o.o9.ODS-C18柱(250nm×4.6nm),流动相A:1.6%甲酸水溶液;B:1.6%甲酸甲醇溶液,.?0004梯度洗脱为0～5min,85%A+15%B;5～10min,80%A+20%B:10～30min,72%A+.-0o00o28%B;30～36min,40%A+60%B;48rain,100%B.检测波长510nlTl,流速为1mL/min.柱温为40℃;外标峰面积法定量ll】.标样色谱图见图1.16.5022.0027.5033.0038.50Time(min)图1标样色谱图Fig.1Chromatogramofstandardsample收稿日期:2005—10—19初稿;2006一O6—21二改稿作者简介:骆军(1971一).男.大学本科.副研究员.研究方向:果树裁培与育种Td:(021)52235473:E-mail:l@vah00.∞m.∞上海农业22卷2结果与分析2.1标准曲线从标准品溶液中精确量取0.25,0.5,1.0,2.5,5.0mL分别定容至25mL,得系列浓度标准品,分别进样10L,测定峰面积.以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,得回归方程分别为:y矢车菊泰3.葡萄糖苷=一7795.73+44794.45X,r=0.99996;Y矢车菊泰3.芸香糖苷=一9236.38+40698.3X,r=0.99985.2.2精密度试验将同一份样品,重复进样7次,测定峰面积积分,2个标样的标准偏差分别为1.7%和2.3%.2.3重复性试验精密称取李同一批样品5份,各0.2g,参照"1.2方法"处理与测定,结果2种花色素苷标准偏差为2.1%和2.0%.2.4稳定性试验同一供李试品溶液,分别于配置后0,2,4,6,8,10,12,24h测定,2种花色素苷峰面积的标准偏差为2.4%和2.7%,表明供试品溶液在24h内基本稳定.2.5回收率测定在李样品中加入标样后测得回收率(表1)在95%～104%之间.表1样品中2种花色素苷的测定结果,回收率和标准偏差Table1Determinationresultsofsamples,recoveryratioandstandarddeviation样品号SampleNo.矢车菊素一3一葡萄糖苷(Cyanln3-glucoside)矢车菊素-3.芸香糖苷(Cyadin3-rutinoside)含量外加花色素量实际检测量回收率标准偏差含量外加花色素量实际检测量回收率标准偏差ContentAddedMeasuredRecoveryStandardContentAddedMeasuredRecoveryStandard (pg)amount(vg)value(vg)ratio(%)deviation(%)(vg)amount(vg)value(gg)ratio(%)devia tion(%)366.56416.16377.59386.7752.0o52.0052.0052.00417.5298470.241o4429.9o101436.17953.1O357.212.70400.001.20364.590.9O373.9352.0o52.0052.0052.00407.13966.1O454.081O41.10417.631022.20423.33950.602.6浸提液pH值的确定从表2可以看出,3种浸提液以pH值为2.65时浸提的比较充分,t测验结果表明,pH 值为2.65的结果与另外2处理的结果在0.05概率水平上差异显着.表2浸提液pH值对浸提效果的影响Table2EffectofpHvalueonextraction3结论采用以上方法对大石早生李和藤稔葡萄果皮中花色素苷含量进行了测定(图2),结果表明:李果皮中含有矢车菊素.3.葡萄糖苷,矢车菊素.3.芸香糖苷2种花色素苷,葡萄果皮中含有少量矢车菊素.3一葡萄糖苷,没有检测到矢车菊素.3.芸香糖苷,各种花色素苷均能分出,这与文献报道结果一致b】.国内测定花色素含量大多采用比色法,如胡桂兵等[4】测定荔枝果皮中花色素含量,王少敏等测苹果果皮中花色素含量均采用分光光度计法.胡亚东等[6报道液相色谱法测定桃果皮花色素含量,用醋酸铵和甲醇做流动相,最低检出限是0.2,g/g,线性范围是0.0625～0.25mg/mL,本方法最低检出限是0.02~,g/mL,线性范围是0.00104--0.0104mg/mL,且重复性好.Francisco等…用酸性甲醇和水做流动相检测桃和李果实花色素含量的方法中,用了4个泵进行梯度洗脱,比较烦琐.实践证明,本方法能够准确定量分析果实中花色素苷含量,精度高,重复性好.3期骆军等:HPLC法测定果实中花色素苷含量0.00360.00270.00180.00090.000012.O0l8.O024.O030.O036.O0Time(min)0.0320.0240.0160.0080.00021.0028.0035.0042.0049.00Time(min)1:车菊素.3.葡萄糖苷(Cyanin.3.glueoside);2:矢车菊素.3-芸香糖苷(Cyanin-3-rutinoside)圈2李,葡萄样品色谱圈Fig.2Chromatogramofsamples参考文献[1]FranciscoA TB,MaIG,Paedarc,eta1.DAI).ESIMSanalysisofphenoliccompoundinnect arine,peachesandplums[J].J.Agile.Food.Chem.2001.49:4748—4760.[2]LauraJaakoh,KaiSHMtt,AnnaMa,eta1.Expressionofgenesinvolvedinanthoey~nbios ynthesisinrelationtOant}Ⅸ蜩nin,proanthoeyanidin,andflavonollevdsduringbilberryfruitdevelopment[J].PlantPhysiol,20 02,130(2):729—739.[3]JoseAFernande~lopez,LuisAlmela,JoseAMunoz,eta1.Dependencebetweencolouran dindividualanthoeyaninoontentindpe~nggrapes[J】.Foodresearchinternational.1998.31(9):667—672.[4]胡桂兵.陈大成,李平.等.荔枝果皮色素,酚类物质与酶活性的动态变化[J].果树科学,2000,17(1):35—40.[5]王少敏.高华君,刘嘉芬,等.套袋短枝红富士果实内含物及果皮色素的变化[J].果树科学,2000,17(1):76—77.[6]胡亚东.贾惠娟.孙崇德,等.桃果实中花青苷的提取,检测及应用[J].果树,2004.21(2):167—169. DeterminationofanthocyanincontentinfruitsbyHPLCLUOJun,ZHANGXue-ying,LIGuang-ping2('ForestryandPomologyResearchInstitute,SAAS,Shanghai201106,China; InstituteforShanghaiAgro-foodStandardsandTestingTechnology,Shanghai201106,Chin a)Abstract:Themethodofdetermininganthocyanincontentinfruitsby唧LCwasestablished.AODC18column(250nmx4.6nm)wasselected.ThemobilephaseAandBWaswaterandmethano lcontaining1.6%formicacidrespectively.ThegradientelutionWas0～5min,85%A+15%B,5～10min,80%A+20%B,10～30min,72%A+28%B,30～36min,40%A+60%B,and36～48min,100%B.ThedetectionwavelengthWas510nrn,andtheflowrate1mE/min.Thecalibrationcurvesforcyan in一3一glucosideandcyanin一3一rutinisidewere1inearwithintherangeof0.00104-0.0104mg/mL.Themeanrecoveryratios forthemwere99.5%and99.25%.andthemeanstandarddeviationsforthem1.98%and2.5%. ThedetectionlimitofthismethodWas0.02~,g/mL.ThemethodWasappliedtoDashizaoshengpl umandFujiminorigrape~mples.Keywords:HPLC;Anthocyanin;Plum;Grape。

花色苷的检测方法我前几天又试了个新方法检测花色苷，这次总算成功了，可把我之前折腾的劲儿都补回来了。

我一开始也是瞎摸索。

先尝试了一种比较基础的方法，就是比色法。

这就好比看颜色猜东西一样。

你得先把样品处理好，这步可不能马虎。

就像做菜得把菜洗干净切好才能下锅似的。

要从植物组织里提取出花色苷来，我当时就是直接研磨植物样本，可这么做有点粗糙，有时候提取得不完全，这就是我的一个教训。

提取出来以后要先调pH值，这个很关键，就像调收音机的频道一样，得调到合适的位置，才能有清晰的反应。

但比色法有个问题就是不太精确，容易受其他物质干扰。

后来我又试过高效液相色谱法（HPLC）。

这个可复杂多了。

这个方法就像警察破案一样，一个一个把里面的成分都分离开，然后识别出来。

首先样品的准备就得特别精细，我那时候为了把样品处理成适合进柱子检测的状态，弄了好久。

要过滤除掉杂质，就像过滤咖啡渣一样，滤不干净柱子就会堵住。

一开始我不知道这个重要性，进去了一些杂质，结果仪器就出问题了，检测结果乱七八糟的。

流动相的选择也很麻烦，就相当于不同的交通工具，得选合适的流动相才能把花色苷这种“乘客”稳稳当当送到目的地给检测出来。

紫外- 可见分光光度法我也捣鼓过。

这方法听起来挺简单的，但是实际操作起来也是有不少坑的。

这个方法是基于花色苷在紫外和可见光谱区有特征吸收峰。

我当时以为只要把样品放进去测就行了，但是发现吸收峰老是对不上标准的值。

后来才意识到样本的浓度还有纯度也是相当会影响检测结果的。

就好比同样一杯果汁，浓的和稀的看起来颜色就不一样，检测出来的值也会不一样。

要说现在觉得哪个最好用，我还不太确定，反正不同的情况可能要用不同的方法。

如果只是初步检测，比色法简单快捷。

但是想要精确检测到花色苷的具体含量和结构，HPLC就比较靠谱了。

要是有大量样本需要粗略判断一下，紫外- 可见分光光度法还是可以试试的，只是得更仔细控制样本的条件罢了。

哦对了，还有纸层析法，这就像小朋友画画用的颜料晕染法差不多。