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结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书
【产品名称】
通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）
英文名称：T-SPOT.TB
【包装规格】
24人份/盒。
【预期用途】
该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细
胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、
非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。两个单独的抗原模仿ESAT-6和
CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩
散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。T-SPOT.TB
被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】
外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。记数PBMCs，保证有标准的细胞数量
用于检测。这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应
孔检测。与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和
其它不必要的物质通过洗涤被去除。标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获
细胞因子。通过洗涤去除任何未标记的抗体。可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉
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T-SPOT.TB实验操作流程
样本要求：
1、 肝素抗凝采血管采集全血样本（无需空腹）
2、 血量要求：
① 一般患者5-8ml
② 免疫力低下患者8-10ml
③ 2岁以下儿童2-3ml
3、 室温（18-25℃）保存与运输，不得冷冻与冷藏
4、 近期有输血或做过PET-CT的患者，建议两周后再送检
5、 运输过程中防止颠簸，避免样本溶血，溶血样本不能进行检测
6、 送检时间：
① 无延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，8小时内完成细胞分离
② 有延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，32小时内完成细胞分离
准备工作
1、配套试剂无菌确认：
1) RPMI-1640培养基
2) AIM-V培养基
3) 淋巴细胞分离液
正常为清澈、透明、无漏液（出现浑浊，有异物，漏液情况的，应停止使用）
2、设备准备：
1) 使用消毒液擦拭生物安全柜并紫外灭菌30min以上
2) 确认培养箱运行在37℃、5％CO₂浓度条件，并确保水盘中有足够的水，防止培养过2
程中干板
3) 使用消毒液擦拭所需移液器，确保移液器表面及腔体无菌
3、耗材准备：
1) 无菌15ml锥底离心管（3-4支/人份）
2) 无菌吸管（2-3支/人份）
3) 无菌加样枪头（10µl、100µl、1ml若干）
4) 无菌1.5ml离心管（1-2支/人份）
5) 无菌50ml离心管（1-2支）（用于实验中分装1640培养基，降低污染风险）
6) 实验中会用到的其他耗材及工具等
4、加延长试剂（T-Cell Xtend）（在实验开始前，已超过8小时的样本需加延长试剂）
1) 按25µl/ml的量加入延长试剂（5ml样本需加入125µl延长试剂）
2) 盖上管盖，轻轻颠倒混匀8-10次（充分混匀并避免溶血）
3) 室温(18-25°C)静置10-25 min后开始实验
实验操作流程及注意事项
第一天（要求全程在II级生物安全柜中操作）
・２６４４・ 中国卫生检验杂志２０１５年８月第２５卷第１６期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂ Ｔｅｃ，Ａｕｇ．２０１５，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．１６
・论著・
Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ在结核感染诊断中的应用研究
刘纯成，刘林飞，李桂珍，张远涛，时玉军，杨鹏飞
淮安市疾病预防控制中心检验科，江苏淮安２２３００１
摘要：目的评价结核感染Ｔ细胞斑点试验（Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ）对诊断结核的应用价值。方法对临床确诊的７４例肺结 核、１７例肺外结核和８８例健康体检者，进行外周血Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ、皮肤结核菌素试验（ＰＰＤ）和萋一尼抗酸染色（ＡＦＢ）的 检测，并比较３种方法的诊断价值。结果Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ检测对肺结核和肺外结核的灵敏度分别为９１．８９％、８８．２３％； Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ对结核的特异度为９３．１８％；ＰＰＤ和ＡＦＢ对肺结核的抗体灵敏度分别为７０．００％、２８．３８％，对肺外结核的 灵敏度分别为：４１．１８％、３５．２９％，特异度分别为９５．４５％、９７．７３％。Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ的灵敏度与二者相比，差异有统计学 意义（Ｐ＜０．０１），特异度与二者相比，差异无统计学意义。结论酶联免疫斑点Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ实验检测结核敏感性强、 特异性高，是快速诊断结核感染的有效手段。 关键词：结核病；结核感染Ｔ细胞斑点试验；灵敏度；特异度 中图分类号：Ｒ５２１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４—８６８５（２０１５）１６—２６４４—０３
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０ｆ Ｔ—ＳＰｏＴ．ＴＢ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ
ＬＩＵ Ｃｈｕｎ—ｃｈｅｎｇ，ＬＩＵ Ｌｉｎ—ｆｅｉ，ＬＩ Ｇｕｉ—ｚｈｅｎ，ＺＨＡＮＧ Ｙｕａｎ—ｔａｏ，ＳＨＩ Ｙｕ—ｊｕｎ，ＹＡＮＧ Ｐｅｎｇ—ｆｅｉ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈｕａｉ’ａｎ Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｈｕａｉ’ａｎ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２３００１，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｐｏｒｔ ｔｅｓｔ（Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ）ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ．ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ（ＰＰＤ）ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ａｃｉｄ—ｆａｓｔ ｓｔａｉｎ ａｎｄ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔ（ＡＦＢ）ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ７４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，１７ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘ— ｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ８８ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｓｅｎ— ｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ—ＳＯＰＴ．ＴＢ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗｅｒｅ ９１．８９％，８８．２３％；ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉ— ｔｙ ０ｆ Ｔ—ＳＰＯＴ．ＴＢ ｆｏｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗａｓ ９３．１８％；Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｅｓｔｓ ｏｆ ＡＦＢ ａｎｄ ＰＰＤ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｔｕ— ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗｅｒｅ ７０．０ｏ％，２８．３８％，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｅｘｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｗｅｒｅ ４１．１８％，３５．２９％，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉ－ ｆｉｅｉｔｙ ｗｅｒｅ ９５．４５％，９７．７３％．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｔ—ＳＯＰＴ．ＴＢ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ｔｕ— ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ＜０．０１）．Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗａｓ ｎｏｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔ—ＳＯＰＴ．ＴＢ ａｓｓａｙ ｉｓ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ＰＰＤ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ＡＦＢ．Ｔ—ＳＯＰＴ．ＴＢ ｈａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｑｕｉｃｋｌｙ ａｎｄ ａｃｃｕ— ｒａｔｅｌｙ． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｐｏｔ ｔｅｓｔ；Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ；Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
结核T-SPOT
传统手段：
结核菌素皮试：低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。
低特异性：与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌有交叉，易造成“假阳性”结果。
细菌学检查：常规培养：2月；快速培养：1周。阳性率取决于采集标本中细菌数量，不利于早期诊断。
病理学检查：阳性率低，对取材标本有较高要求，有创伤，对肉芽肿性病变需进一步鉴别。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ），因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。
由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。
T-SPOT.TB 高特异性
ESAT-6（早期靶原6）&CFP10（培养滤液蛋白10）均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域。
仅结核分枝杆菌复合群（人型，牛型，非洲型）存在RD1区基因。
卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因。
T-SPOT.TB 不会受卡介苗接种影响。 通常阴性对照没有或仅有很少斑点。
根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果；
阴性对照孔斑点数为0-5，阳性样本应为：
（抗原A或抗原B斑点数）-（阴性对照孔斑点数）≥6.
当阴性对照孔斑点数≥6 spot，阳性样本应为
（抗原A或抗原B斑点数）≥2×（阴性对照孔斑点数）
如果阳性对照孔结果良好，但抗原A或抗原B均达不到阳性样本判断标准，则结果为阴性。
阳性结果说明患者体内存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。
阴性结果提示患者可能不含针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。
T-SPOT.TB 检测单个反应细胞
可以检测样品中每一个反应的T细胞
即使在免疫功能低下的患者，只要单个的T淋巴细胞有反应，也同样可以被检出。
T-SPOT.TB 检测所有类型的T细胞亚型
