细胞破碎原理

细胞破碎试验方案

生物工程（2）班 1102012030—刘洋

一、实验目的

酵母细胞破碎，并达到75%以上的细胞破碎率

二、实验原理

漩涡振荡+酸解+加热

三、器材与试剂

漩涡振荡器

高速冷冻离心机

干酵母粉

酵母裂解缓冲液

冰

四、实验步骤

一、酵母菌液制备

称取市售干酵母粉3g加入10ml浓度。准备好水浴锅

二、测量

破碎前取1ml，适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数

三、取制好的酵母菌液，等体积的加入，使用漩涡振荡器振荡30min，再50摄氏度水浴10min。

同时换

1、换2mol/l的HCl

2、60摄氏度水浴10min

四、最终计数

结束后取1ml菌液，用血细胞计数板在显微镜下计数

细胞破碎技术与方法

细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。

由于细菌、酵母、真菌、植物都有细胞壁，但成分不同，且同类细胞结成的网状结构不同，因此其细胞壁的坚固程度不同，总体呈现递增态势。动物细胞虽没有细胞壁，但具有细胞膜，也需要一定的细胞破碎方法来破膜，达到提取产物的目的。

细胞破碎的方法主要分为化学法和机械法两大类。具体如下：

化学法

渗透冲击破碎法

• 方法：渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。

反复冻融法

• 方法：将细胞放在低温下冷冻(约-15℃)，然后在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。

酶溶破碎发法 • 方法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感，加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后，使之转为对溶菌酶敏感而溶解。

• 特点：

a) 此法适用多种微生物

b) 具有作用条件温和

c) 内含物成分不易受到破坏

d) 细胞壁损坏的程度可以控制

• 存在的问题：

a) 易造成产物抑制作用

b) 溶酶价格高

c) 酶溶法通用性差

化学试剂法

• 方法：某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。SDS(十二烷基磺酸钠)是典型的阴离子表面活性剂

[机械法]细胞破碎的方法、原理和优缺点

1、高速组织捣碎机

捣碎机转速可达10,000r/min，具高速转动的锋利的刀片，宜用于动物内脏组织的破碎。

操作：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

特点：由于旋转刀片的机械切力很大，制备一些较大分子如核酸则很少使用。

2、组织匀浆器

制作匀浆器的材料通常用玻璃，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。

操作：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。

特点：匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

但是，这种方法也较易造成堵塞；团状或丝状真菌、较小的革兰氏阳性菌以及某些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。

3、研钵

多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。

值得注意的是：在研磨过程中局部往往生热导致变性或pH值变化，尤其是研磨玻璃粉和氧化铝时；而且磨细剂的吸附也可导致损失。

4、细菌磨

是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。

破碎技术 除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。

1.机械破碎

(1)研磨研磨是将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。

(2)匀浆匀浆这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min-20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒-20秒，停10秒-20秒，可反复多次。(3)胶体磨胶体磨的基本原理是流体或半流体物料在离心力的作用下，强制通过高速相对运动的定齿与动齿之间，使物料受到强大的剪切力，磨擦力、高频振动和高速旋涡等复杂力等作用，有效地被粉碎、乳化、均质、混合，从而达到精细超微的效果。定转子间的高速相对运动是使胶体磨工作获得物理微细度的主要条件，只有提高磨盘的精密度与线速度，才能达到良好的加工效果。

2. 物理破碎

(1)压榨压榨是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa-2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。

(2)冷热交替冷热交替是在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎，细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此技术。