酒曲中产酒酵母菌的筛选及发酵能力的测定
一、实验目的
1.掌握酵母菌的筛选方法
2.复习用显微镜观察菌形态的操作步骤
3.掌握酵母生产性能的测定：酵母发酵力的测定、酵母产酒精能力的测定、及其乃酒精的能力、
4.学习酒精出酒率的计算
二、实验原理
酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条件下，液体培养比霉菌快。菌落于细菌相似，较大而厚，多数不透明，菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色，圆形、椭圆、卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。
酒曲中含有细菌，霉菌，酵母菌等多种菌体，在菌体的分离提取中，通过对原菌的稀释，涂布，多次划线而使各种菌体得以分开，形成单菌落。通过观察菌落的形态以及在显微镜下对单菌体形态特征的观察确定酵母菌个体。
三、实验材料
1．实验器材
恒温培养箱，高压灭菌锅，三角瓶，电炉，石棉网，水浴锅，移液管，移液管架，容量瓶，冷凝管，蒸馏烧瓶，铁架台，软管，天平，酒精计，超净工作台，试管，培养皿，接种环，玻璃棒，涂布棒，漏斗，滤纸，玻璃珠，纱布，脱脂棉，酒精灯，白瓷缸，分析天平，量筒，牛皮纸，报纸
2．试剂及药品
无水乙醇，蒸馏水，葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸铵，豆芽，琼脂，蛋白胨，酵母浸膏，硫酸镁，氯化钙。
3．实验材料：酒曲
4．种子培养基
豆芽汁培养基：
黄豆芽 100g； 葡萄糖 50g；琼脂 20g； 水 1000ml；PH 自然。
5．发酵培养基
A 酵母抽提物0.75 g，
B 蛋白胨0.75 g，
C 硫酸铵0.25 g，
D 磷酸二氢钾0.125 g，
E 硫酸镁0.09 g，
F 氯化钙0.07 g，
G 葡萄糖25 g，
H 蒸馏水250mL。
四、方法步骤
1、产酒酵母菌株的初选
（1）实验器材的准备与灭菌
1）清洗培养皿、锥形瓶数个，在干燥箱中干燥
2）检查并接通高压蒸汽灭菌锅，打开电源，在锅内加水，直至水位显示为高水位，设定温度为121℃，加热时间30min。
酿酒酵母筛选及乙醇发酵条件的优化
摘要：燃料乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞活性被高浓度乙醇严重抑制而导致发酵提前终止，生产强度严重降低，因此构建同时具有高耐受性、高发酵性能的菌株一直是发酵工业追求的目标。选取酿酒酵母细胞形态调节关键基因小GTP酶家族成员Ｒho1，构建易错PCＲ产物文库，以酿酒酵母S288c为出发菌株采取“富集-自然生长-复筛”的筛选策略，成功筛选得到两株乙醇胁迫耐受性与发酵性能均提高的突变株M2和M5。测序发现突变株过表达的Ｒho1序列出现了3～5个氨基酸的突变和大片段的缺失突变。以300g/L起始葡萄糖进行乙醇发酵，72h时，M2和M5的乙醇滴度比对照菌株分别提高了19．4%和22．3%，超高浓度乙醇发酵能力显著提高。本研究为利用蛋白定向进化方法改良酵母菌复杂表型提供了新的作用靶点。
关键词：酿酒酵母；筛选；乙醇发酵；条件优化
引言
乙醇由于具有环保、可再生及辛烷值高等优点，被认为是极具发展前景的可再生清洁能源之一。以农业废弃物和木质纤维素为原料的第二代乙醇工业生产技术不仅降低了燃料乙醇的生产成本，还可以解决农林废弃物对环境的不利影响。咖啡果皮作为咖啡产业的废弃物，被证实富含糖类、纤维素和半纤维素等物质，是生物乙醇发酵的优质原料。与此同时，咖啡湿法发酵液中含有大量酵母，其不仅可以有效利用咖啡果皮中的糖类物质，还对咖啡中的绿原酸、咖啡酸等抑菌物质具有良好的抗性 。因此，试验从云南小粒咖啡湿法发酵液中分离优良的产醇酵母，并对其培养条件进行优化，从而为以咖啡果皮为原料的乙醇发酵奠定前期基础。
1材料与方法
1．1材料 ①LB培养基:NaCl10，酵母粉5，胰蛋白胨10，pH7．0～7．2;②YPD培养基:葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉5;③酵母高浓度(Highgravity，HG)发酵培养基:葡萄糖200，蛋白胨10，酵母粉5;④酵母超高浓度(Veryhighgravity，VHG)发酵培养基:葡萄糖300或400，蛋白胨10，酵母粉5。固体培养基添加2%(质量分数)的琼脂。PCＲ仪(德国Eppendorf公司);核酸电泳仪(北京市六一仪器厂);LＲH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司);DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);H2P-250全温培养振荡器(上海精宏实验设备有限公司);ZHJH-1112垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司);TGL-16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);Thermo酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司);SBA生物传感仪(山东省科学院生物研究所)。
《UV处理筛选耐高浓度乙醇酿酒酵母菌株》
诱变方法：
预处理：将诱变所需的仪器设备在无菌操作台上灭菌，紫外灯预热30min，将磁力搅拌器的电压调至4V，将制备好的菌悬液倒入含有磁珠的平皿中，开启磁力搅拌器的电源开关，待菌体均匀混合后，开始诱变。
诱变：将菌悬液用一次性塑料针管吸取5ml于编号的试管中，将紫外灯对准平皿的同时开始记时，每10s取一次样于对应试管中，直至90s停止照射，则得到10种菌悬液。
后处理：将诱变之后的菌悬液依次稀释10倍、100倍，再进行涂布，每次2滴（约0.1ml）即可，再将未做稀释处理的诱变菌株的10种菌悬液依次涂布，再重复一次，10倍、100倍也做同样处理，共60个培养皿，涂好后，放入暗箱（防止光复活）培养箱于25℃培养24h。
分析方法：
酵母生长的测定：测生长量，包括称干重法、比浊法、测含氮量法等。
记繁殖数，包括计数板法、菌落计数法等
酵母死亡率的测定：
耐酒精酵母筛选方法：
灭菌麦芽汁→冷却为40℃左右→加入无水乙醇，配成浓度分别为4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、11%vol、12%vol、14%vol→紫外照射后的平板→挑取大且光滑的单菌落→接种待测酵母菌→25℃培养24h→观察产气情况→记录结果→分离纯化测定时的菌种→保藏菌种→ 挑取单菌落→接种针点于TTC下层平板→30℃恒温培养24h→倒TTC上层平板→30℃恒温培养3h→找出TTC上层平板上变红的菌落（候选的突变体）→转接于固体斜面→30℃恒温培养24h→菌落形态观察与鉴定→显微形态的观察→挑出变红（深色）的单菌落→接种于麦芽汁培养基中→扩大培养→分离纯化菌种→不同温度条件下发酵7d→每隔24h测其pH值、酸度，待发酵结束时测酒精度、耗糖率和总酸度。
镜检方法：
用胶头滴管吸取摇匀的菌悬液滴到载玻片上，盖上盖玻片，先用低倍镜观察，待视野清晰之后换高倍镜观察，一般40倍物镜即可，若菌体较密集，则将菌悬液适当稀释，直至稀释度适合为止。
酿酒酵母筛选技术及其应用在对抗化学物质中的方法
酿酒酵母是酿制酒类和其他发酵食品的必要微生物，它们将糖分分解为乙醇和二氧化碳，为酒类饮品提供了口感和营养成分。然而，现代社会中广泛使用的化学物质，如农药、除草剂、防腐剂等，对酿酒酵母的生长和酵母发酵道程产生了很大影响。为了提高酿酒的质量和安全，人们开发了一系列酵母筛选技术，并将其应用于对抗化学物质的酒类生产过程中。
一、 酿酒酵母筛选技术
1. 正向筛选法
正向筛选法是指通过对不同来源的酵母菌进行筛选，选择出能够适应目标发酵条件的良好发酵酵母的方法。该方法适用于筛选大量酿酒酵母，并且其优点在于易于操作和实用性强。正向筛选法的条件有温度、pH值、酒精浓度等因素。
2. 逆向筛选法
逆向筛选法是指通过在不利的发酵条件下培养酿酒酵母，来筛选出适应压力和毒素环境的酵母。例如，逆向筛选法可以用于寻找能适应高酒度环境的酿酒酵母，或者针对特定氟化物类毒素的应用。
3. 基因编辑技术
基因编辑技术目前已成为越来越广泛的酿酒酵母定向选育方法。它可以用来创造崭新的酿酒酵母类型，通过改变酵母菌的基因序列或操纵代谢途径来改变酵母的酿酒特性。具体而言，基因编辑技术可以删减或改写过程中的目标基因，以实现对酿酒酵母生长和代谢的有针对性的调整。
二、 酿酒酵母筛选技术在对抗化学物质中的应用
1. 农药和除草剂的应对
农药和除草剂对食品的影响是全球性的问题，而这些问题也包括了酒类生产。环境污染和气候变化可能影响到酿酒酵母的存活和繁殖，导致酒类质量下降。针对这些问题，酿酒酵母筛选技术通过逆向筛选法进行酿酒酵母的筛选，以选择表现更强的酵母，提高其抗药性和耐草药性，从而保证酒类的质量安全。
2. 防腐剂的应对
维生素C、硫酸、亚硫酸，以及其他类似的防腐剂，在酒类生产过程中得到广泛使用。然而，过量的防腐剂不仅可能改变酒类的味道和营养成分，还可能对酿酒酵母的生长和代谢产生不良影响。通过正向筛选法，可以筛选出对防腐剂存在较强耐受性的酵母株，从而在酒类生产中避免防腐剂对酵母的干扰。
