酵母菌的分类鉴定

浙江大学学报（农业与生命科学版）　３９（１）：７５～８３，２０１３　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃ．　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．）　ｈｔｔｐ：ｆ　ｆｗｗｗ　ｊｏｕｒｎａｌｓ　ｚｊｕ．ｅｄｕ　ｃｎ／ａｇｒ　Ｅ　ｍａｉｌ：ｚｄｘｂｎｓｂ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　ＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８　９２０９．２０１２．０４．２３１　

酵母菌Ａ８２—２的分类鉴定及对桃软腐病菌的抑菌效果研究　

周小虹　，闫冬　，陆兆新，吕凤霞，沈昌，别小妹　（南京农业大学食品科技学院，南京２１００９５）　

摘要　对１株具有抗桃软腐病菌的酵母菌Ａ８２　２进行了系统分类鉴定．通过４种不同的抑茵实验研究该酵母茵对　桃软腐病菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）的拮抗作用：平板抑菌实验表明菌株Ａ８２—２对Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ为拮抗阳性；菌株混　合培养实验说明菌株Ａ８２　２对Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ抑菌效果明显，且与菌株Ａ８２　２菌悬液的舍菌量呈正相关；发酵液抑　菌实验表明菌株Ａ８２—２并没有向胞外分泌抑菌活性物质，说明菌株Ａ８２—２不是通过产生抑菌物质对Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ　产生抑制作用，而是通过菌株之间的营养竞争和空间竞争产生拮抗作用；活体研究表明：１×１０　ｃｆｕ／ｍＩ　菌株Ａ８２　２，对接种了１×ｌ０　孢子／ｍＩ　桃软腐病菌的桃果实具有显著的抑制作用．采用形态特征观察和生理生化特性分析　对该酵母进行了传统分类鉴定，进一步利用分子生物学方法对其２６Ｓ　ｒＤＮＡ序列进行分析，确定该拮抗酵母菌为　异常毕赤酵母（Ｐｉｅｈｉａ　ａｎｏｍａｌａ），该菌在果蔬病害的生物防治和防腐保鲜方面具有很高的应用潜力．　

关键词拮抗酵母；鉴定；２６Ｓ　ｒＤＮＡ；桃软腐病菌　中图分类号Ｑ　９３９．５；Ｓ　４３２．２　文献标志码Ａ　

Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｓｔｒａｉｎ　Ａ８２—２　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　

科技创新　２０１３年第２４　Ｉ科技创新与应用　酸骆驼奶中酵母菌的分离与鉴定　邓时莉　吴跃华ｚ　（１、新疆石河子大学，新疆石河子８３２０００　２、新疆石河子职业技术学院，新疆石河子８３２０００）　摘要：酸骆驼奶是一种营养价值很高的具有浓厚民族特色的保健饮品。本文以酸骆驼奶中酵母茵为研究对象，通过对其中的　酵母菌扩大培养并且分离出较纯的菌株进行鉴定。　关键词：酸骆驼奶；酵母菌；分离鉴定　１引言　作为一种高品质的乳饮料，酸骆驼奶有着悠久的历史，我国的　哈萨克族和蒙古族等民族在远古时代就有制作和饮用骆驼奶的习　惯。酸骆驼奶中营养丰富，更加适合于人体代谢。传统的酸骆驼奶的　制作方法，使其中的微生物得到了很好的保存，尤其是酵母菌的自　然特性，使得酵母菌在乳制品中发挥着极其重要的作用。自然发酵　骆驼奶中含有大量的酵母菌，它与骆驼奶的生物活性和医疗保健作　用密切相关，不仅能抵抗发酵过程中有害菌的污染，而且在代谢过　程中能够产生抗菌物质并促进微生物Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１２等的合成。　２试验材料　２．１试验原料　酸骆驼奶１０ｍｌ、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉、牛肉膏、氯化　钠、玉米粉、干麦芽酚、干酵母粉。　２．２培养基　ＹＥＰＤ培养基、硝酸盐还原试验培养基、Ｇｏｒｏｄｋｏｗａ琼脂培养基、　醋酸盐琼脂培养基、玉米粉琼脂培养基　２．３试验仪器　生化恒温培养箱、超净工作台、灭菌锅、冰箱、电子分析天平、热　空气消毒箱、双频数控超声波清洗器。　３试验方法　菌种活化一扩大培养一初次扩培一二次扩培一收获一收集菌　体一形态学鉴定一繁殖方式的观察一生化鉴定一收集数据　３．１扩大培养　所使用的培养基为ＹＥＰＤ液体培养基，酵母粉５ｇ，蛋白胨１０ｇ，　葡萄糖１０ｇ，蒸馏水５００ｍＬ，调至Ｐｈ　６．０（ＮａｏＨ）。取在零摄氏度冰箱　中保存的菌液２ｍｌ加入到５００ｍｌＹＥＰＤ液体培养基中活化１２ｈ，将　２ｍｌ活化的菌液再加入到１００ｍｌ　ＹＥＰＤ液体培养基中培养２４ｈ，最　后将２０ｍｌ菌液加入到５００ｍｌ　ＹＥＰＤ培养基中进行扩大培养。　３．２收集菌体　配置ＹＥＰＤ固体培养基，即酵母粉５ｇ，蛋白胨１０ｇ，葡萄糖１０ｇ，　蒸馏水５００ｍＬ，琼脂粉１０ｇ调至Ｐｈ６．０（ＮａｏＨ），并且在高压蒸汽灭菌　锅１２１摄氏度下灭菌２０ｍｉｎ，然后将培养基倾倒到１０支试管中并形　成斜面。将扩大培养的菌液在无菌实验室中接种到试管斜面上，放　在２９．５摄氏度的恒温箱中培养２４ｈ。将样品用平板稀释法在沙堡弱　氏培养基上于２５℃培养１～３ｄ。挑取疑似酵母菌的单菌落，美蓝染色　后做显微镜检查，确认为酵母菌的接种到沙堡弱氏斜面培养基上，　纯化２－３次，置于４℃冰箱中保存。　３．３实验方案　３．３．１形态学鉴定（菌落形态、细胞形态、菌丝生成）　将被检菌用平板稀释法在沙堡弱氏培养基上２Ｏ～２５℃培养ｌ一　３ｄ，选择单个菌落观察其颜色、形状、透明、光滑、湿润和边缘整齐等　特征。而后将被检菌接种到沙堡弱氏斜面培养基上，２５℃培养２４ｈ。　美蓝染色后进行显微镜检查，观察被检菌的繁殖方式是出芽生殖或　者分裂生殖。　３．３．２酵母菌的生化鉴定　（１）不同生长条件对菌株的影响　过程：把菌种接种在相同的ＹＥＰＤ液体培养基上，并分装成不　同的试管当中，放在不同温度的培养箱中进行培养，１号恒温箱温度　为４￣Ｃ，２号恒温箱温度为２９￣Ｃ，３号恒温箱温度为３９℃，培养１～２ｄ，　取出并且观察酵母菌在试管中的生长情况；把菌种接种在不同ＰＨ　和酒精度的液体培养基上，并分装成不同的试管当中，将几支试管　同时置于２９￣Ｃ恒温箱中培养１～２ｄ，取出并且观察酵母菌在试管中　的生长情况。　（２）硝酸盐的还原实验　过程：将被检菌的生长旺盛的酵母菌接种在硝酸盐培养基中，　２５￣Ｃ下培养１－７ｄ，滴加甲、乙混合液（１：１），每５ｍＬ培养液加混合液　０．１ｍＬ后，观察结果，呈现红色为阳性，若无红色出现，应进一步检　查，向上述试验管中加少许锌粉，若出现红色，表示硝酸盐仍存在，　为阴性反应（硝酸盐在醋酸的存在下，锌粉将其还原成亚硝酸盐，进　一步形成芳基肼紫红色化合物）；若不产生红色，表示硝酸盐已被还　原为氨和氮，仍为阳性反应。（注：甲液：将对氨基苯磺酸０．８ｇ溶解于　２．５ｍｏｌ／Ｌ乙酸溶液１００ｍＬ中。乙液：将甲萘胺０．５ｇ溶解于２．５ｍｏｌ／Ｌ　乙酸溶液１００ｍＬ中。使用方法：接种后在３６＿＋１￣Ｃ培养１—４ｄ，加入甲　液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数　分钟内显红色。）　（３）类淀粉物质生成实验　过程：将酵母菌接种到含有一种糖或一种多烃糖醇的液体培养　集中，待生长以后，取一滴卢戈氏碘液滴人该试管中，然后把培养基　和酵母菌一起摇动。如果呈现蓝色，紫色或者是绿色表示该实验结　果是阳性的。卢戈氏碘液是５ｇ碘、１０ｇ碘化钾加水到１００ｍｌ配制而　成的，先用１０ｍｌ水将碘和碘化钾溶解，然后再将其余的水加入摇　匀。应用时，该溶液还需再以１：５的比例稀释。　（４）糖类发酵实验　过程：本实验需要使用杜氏管，即一支约１５０ｍｍ￣１２ｍｍ的大试　管中间套有一支约５０ｍｍ￣６ｍｍ的小试管。在０．６％酵母浸汁中加人　葡萄糖，使糖浓度达到２％，再将其分装于含杜氏管的试管中ｆ注意　使杜氏管中没有气泡）。在１１５％高压灭菌１５ｍｉｎ后，将生长旺盛的　菌种接人发酵管中，２５℃培养，每天观察结果。　（５）碳源同化实验　过程：将液体培养基分装在数支试管中，每支试管中的培养基　是等量的。该培养基除了用不含碳源的作为阴性对照外，都含有一　种试验基质。为了接种，试验用酵母菌适合生长的培养基上，如麦芽　汁一酵母膏一葡萄糖一蛋白胨琼脂，并把生长活泼的培养物悬浮在含　氮源的培养基内。为保持培养结果稳定，通常做法就是使试管倾斜，　通过暴露最大的表面来增加通气量，而且每天用手振动它，也可以　放到要床上进行振动。通常用肉眼来判别菌的生长，把阴性反应管　和阳性反应管作为对照。　４试验结果　将纯化出来的菌种进行活化培养，稀释涂布，培养４８ｈ后，观察　其菌落形态，并挑取单菌落进行革兰氏染色，观察其菌体形态可以　看出，此酵母菌为革兰氏阳性菌，其形态特征表现为形状轻微不规　则，圆形末端的菌，通常单个，成对，小簇存在。菌落为不规则型，圆　形凸起，光滑，边缘整齐，菌落颜色为白色或乳白色。　菌细胞１－９号中：１、２号菌，椭圆形，有假菌丝形成，子囊内有圆　形或椭圆形的子囊无掷孢子。葡萄糖发酵阳性，硝酸盐还原反应阴　性、类淀粉物质的生成试验阴性或阳性。形态学、生化特性符合酵母　属特性，归为酵母属。７号菌细胞为芽殖，不形成菌丝，子囊内有１　４　个孢子。葡萄糖发酵阳性，硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验阴　性。形态学、生化特性符合有孢圆酵母属特性，归为有孢圆酵母属。　３、４、８、９号菌细胞均腊肠形。４株菌均无有性生殖，有菌丝形成，葡　萄糖发酵阳性，硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验阴性。形态学、　生化特性符合克勒克酵母属特性，归为克勒克酵母属。　参考文献　［１］哈斯苏荣．酸马奶及其医学价值ｆＪ１．中国中药杂志，２００３，２８（１）．　．　［２】周传云，聂明，万佳蓉．古老而新型的发酵奶：开菲尔『Ｊ１．食品机械，　２００３（５）．　［３］王庭柱，高学军，丛玉婷，范晓男．发酵乳球菌菌株的分离鉴定　．　食品科学，２００７，４３（７）．　作者简介：邓时莉（１９８０，３一），女，汉族，石河子大学食品学院食　品工程专业研究生，新疆石河子职业技术学院讲师　吴跃华，男，就读于新疆石河子职业技术学院。　一

霉菌和酵母菌检测

1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1.1 冰箱：2℃～5℃。

1.2 恒温培养箱：28℃±1℃。

1.3 均质器。

1.4 恒温振荡器。

1.5 显微镜：10×～100×。

1.6 电子天平：感量0.1g。

1.7 无菌锥形瓶:容量500ml、250ml。

1.8 无菌广口瓶：500ml。

1.9 无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。

1.10 无菌平皿：直径90mm。

1.11 无菌试管：10mm×75mm。

1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。

2 培养基和试剂

2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A中A.1。

2.2 孟加拉红培养基：见附录A中A.2。

3 操作方法

3.1 试验前准备

3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。

3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。

3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。

3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。

3.2 样品稀释液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

3.2.1 固体和半固体样品

称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。

3.2.2 液体样品

实验十 酵母菌形态观察及死活细胞鉴定

一．目的要求：

1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖。

2掌握酵母菌的死活细胞的鉴别。

3.掌握酵母子囊孢子的观察方法。

二.实验原理

1．形态观察

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方法。

2.死活鉴定

本实验通过用美蓝染色制成水浸片，来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。

3.子囊孢子

子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母菌要选择适合形成子囊孢子的培养基。麦氏培养基（葡萄糖—醋酸钠培养基）有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。

三.实验器材

1.菌种：酿酒酵母培养约2d的酵母合成培养基和麦氏琼脂斜面。

2.溶液或试剂：0.05%和0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用碘液。5%的孔雀绿水溶液，0.5%的番红水溶液，95%的乙醇

3.仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片等。

四.操作步骤

1.酵母合成培养基的配制

按配方称取酵母合成培养基各组分，配置3瓶60ml的培养液各装入250ml锥形瓶中，再用六层纱布封口，用牛皮纸包扎后121℃灭菌20min。灭菌后置于摇床上震荡。

2.麦氏琼脂的配制

按配方称取麦氏琼脂各组分，制成10只斜面，每只内培养液为5至10ml，按常规方法包扎后121℃灭菌20min。