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northern blot 的主要操作流程

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northern blot 的主要操作流程

Northern Blot 是一种用于检测样品中特定 RNA

分子大小和数量的重要分子生物学技术。下面是 Northern Blot 的主要操作流程：

1. 样品准备：选择适合的样品，可以是植物、动物或微生物的总 RNA

提取物，或组织匀浆液等。将样品在沸水中加热变性，以解开 RNA

的二级结构，提高检测的灵敏度。

2. 凝胶电泳：将变性后的 RNA

样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据分子量大小将不同大小的 RNA

分开。电泳结束后，将凝胶放入甲醛溶液中固定，以保持 RNA 分子在凝胶中的位置。

3. 转膜：将固定好的凝胶放入 Northern Blot 膜上，使凝胶中的 RNA

分子按照大小顺序被转移到膜上。这一步需要使用适当的缓冲液和转移膜，以确保转移过程的顺利进行。 4.

杂交：将膜在适量的预杂交液中杂交，以封闭膜上的非特异性位点。然后，将杂交液中的探针加入到膜中，使探针与目标 RNA 分子特异性结合。

5.

洗膜：在洗膜液中清洗杂交后的膜，以去除未结合的探针和其他杂质。这一步需要使用适当的洗膜液和温度条件，以确保特异性杂交的信号被保留下来。

6.

检测：将杂交后的膜置于放射性自显影液或化学发光试剂中曝光，以检测目标 RNA 分子杂交信号。通过显影或发光信号，可以观察到特定大小的目标

RNA 分子是否存在，并比较其相对丰度。

7. 数据分析：对 Northern Blot 实验数据进行定量分析，比较不同样品中目标

RNA

分子的大小和相对丰度。这些数据可以用于进一步研究基因表达水平、转录本差异等生物学问题。

Northern Blot

技术是一种可靠的分子生物学方法，可以用于检测和定量分析样品中特定 RNA

分子的表达水平。该技术需要经过严格的实验操作和数据分析处理，以确保结果的准确性和可靠性。

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Northern blot

Northern blot

1 Northern blot

1. 将总RNA转移到尼龙膜上：

试剂：

溶液 成分 配方

DEPC H2O DEPC (焦炭酸二乙酯)

H2O H2O中加入0.1% DEPC→ 混匀→ 37℃放置12h→ 121℃灭菌40min

10×MOPS 200mM MOPS- NaOH

50mM NaAC

10mM EDTA

pH7.0 DEPC H2O

160ml

MOPS

8.372g

1M NaAC

10ml

0.5M EDTA 4ml

用2M NaOH调pH至7.0，DEPC H2O定容到200ml， 灭菌。

RNA 甲醛变性胶loading buffer 1×MOPS

17%甲醛

50% 去离子甲酰胺

0.01%溴酚蓝

10%甘油 10×MOPS 50ul

甲醛

83ul

50% 去离子甲酰胺 250ul

溴酚蓝

0.01%

甘油

50ul

DEPC H2O 67ml

20×SSC 3M NaCl

0.3M 柠檬酸钠

pH7.0 800ml H2O +175.3g NaCl + 88.2g柠檬酸钠→ 用NaOH调pH至7.0→ 定容到1L→

0.1% DEPC处理→ 121℃灭菌40min

2 步骤：

1) 电泳槽、胶板及梳子先用0.2M NaOH+0.1%SDS浸泡，再用水冲洗干净，最后用DEPC H2O 淋洗。用到的玻璃器皿、刀片等要180℃烘烤6h。枪头、离心管和滤纸等要121℃灭菌40min。

2) 配1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶100 ml。称1.2 g琼脂糖，加73 ml DEPC处理的双蒸水，溶解后稍冷却，加入10 ml 10×MOPS，冷至70℃时加17 ml 甲醛，混匀， 然后倒入胶槽中。

☆ 法务工作操作主要流程

☆ 法务工作操作主要流程

说明: 填充绿色表示法务部门职责 填充紫色表示相关部门职责 填充红色表示副总或总经理职责主要分项事前预防分体系事中实施分体系事后纠正分体系标准合同类(零部件采购标准合同, 普通设备采购标准合同, 一般销售标准合同等)重大合同(特殊销售合同,重大工程,设备安装合同等)保密合同(技术保密合同,商业保密合同)图例:法务工作操作主要流程(样)

部门报告,方案,草案,联络书正式文本或定案合议或会议决裁或签订实施保存终止事前审查法务合同相关部领导标准保存相关事前合同合同实施保存违约法务对策相关部领导实施终止实施报告副总或报送副总或相关部联络书法务合同相关部领导审批副总或事前合同合同实施法务报送违约法务对策相关部领导实施终止副总或实施实施报送报送

报送报送相关部签约人选联络书法务合同相关部副总或领导审批相关部合同合同保存违约实施法务对策相关部领导实施终止实施报送报送相关部

NORTHERN BLOT基本概述

NORTHERN BLOT基本概述

NORTHERN BLOT基本概述

一、目的

学习NORTHERN BLOT技术，通过本实验了解NORTHERN BLOT的应用

二、概述

Northern blot的基本概述是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移至尼龙膜等固相膜载体上，用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性结合杂交信号，经放射自显影或现色反应，对杂交信号进行分析。

将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。

三、试剂及材料

1. 水平电泳仪及电泳槽

2. 制冰机

3. 恒温水浴箱

4. 凝胶成像系统

5. EP管、移液器及Tip头

6. 5×MOPS电泳buffer （0.2M MOPS pH 7.0, 0.25NaAc,5mM

EDTA ）

7. 甲醛凝胶加样buffer （1mM EDTA, 0.25%溴酚蓝,50％甘油） 8. EB

9. DIG标记EGFR探针

10.DIG Easy Hyb工作液

11.20×SSC （3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸钠,用1mol/L HCl

调节pH 至7.0）

12.鲑精DNA10mg/ml）

四、操作步骤

（一）、RNA转移与固定

1. 变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝胶片刻，10×SSC中浸泡平衡凝胶30min。

2. 按southern blot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。

3. 1×SSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。

4. RNA染色，干燥的尼龙膜先于5％冰乙酸中室温浸泡15min。后于0.5mol/L乙酸钠和0.04％亚甲蓝溶液中浸泡5-10min.去离子水淋洗膜5-10min，可见RNA标准及28S及18SRNA的条带，软铅笔标记。

Northern Blot 实验 Protocol

Northern Blot 实验 Protocol

Northern Blot（Northern印迹杂交）是一种用于检测RNA表达水平的方法，它通过将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与特定基因互补配对的探针进行杂交，从而检测目的片段。

实验原理：Northern Blot利用了RNA的分子量大小不同，通过电泳方法将其按照大小分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。探针与特定的基因互补配对，当探针与目标RNA片段杂交时，可以检测到特定基因的表达情况。

所需试剂和耗材：

1. RNA样品或mRNA样品。

2. 探针模板DNA。

3. 尼龙膜。

4. NorthernMax Kit（Cat. # 1940,Ambion, Inc.）等试剂。

实验仪器：

1. 恒温水浴箱。

2. 电泳仪。

3. 凝胶成像系统。

4. 真空转移仪和真空泵。

5. UV交联仪。

6. 杂交炉。

7. 恒温摇床。 8. 脱色摇床。

9. 漩涡振荡器。

10. 分光光度计。

11. 微量移液器。

12. 电炉或微波炉。

13. 离心管。

14. 烧杯。

15. 量筒。

16. 三角瓶等。

准备工作：

1. 准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存和使用。

2. 确保实验区域干净整洁，并无菌操作。

3. 了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。

4. 使用DEPC水处理相关玻璃器皿，保证无RNA酶的污染。

实验方法：

1. 将RNA样品进行电泳分离，根据分子量大小将RNA分子分离至琼脂糖凝胶中。

2. 将凝胶中的RNA分子转印到硝酸纤维素膜上。

3. 将硝酸纤维素膜上的RNA与特定基因的探针进行杂交。 4. 通过底片暗盒制作X光底片，以检测RNA的表达情况。

5. 对硝酸纤维素膜进行脱色处理，以便进一步检测和分析。

6. 通过分光光度计测定X光底片的吸光度，以定量分析RNA的表达水平。

7. 根据定量分析结果进行数据分析，绘制图表等。

注意事项：