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Western blot的原理、操作及注意事项

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Western blot的道理、操纵及留意事项之杨若古兰创作

道理：

通过电泳区分分歧的组分，并转移至固相撑持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物资进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白.

一、抗原的选择和制备

A：样品的制备

1 组织：

组织的处理方法：组织洗濯后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样.

2 细胞：

细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样. 3 分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入βME、溴酚蓝制样.

B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量缘由

1.双缩脲法：

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法.在须要快速，但不很精确的测定中，经常使用此法.硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的初期阶段是非常有益的.双缩脲法的道理是Cu2+与蛋白质的肽键，和酪氨酸残基络合，构成紫蓝色络合物，此物在540nm波利益有最大接收.双缩脲法经常使用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定.干扰物有硫醇，和具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等.可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定.

2.Lowry法：

此法是双缩脲法的进一步发展.他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中构成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷磷钨酸试剂（福林酚试剂），结果得到深蓝色物.此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液.其干扰物资与双缩脲法不异，而且受他们的影响更大，硫醇和很多其他物资的存在会使结果严重偏差.另外要留意的是，加入福林试剂时要特别当心，试剂只在酸性pH环境中才波动，上述提到的还原反应只要在pH10时才发生，是以，福林试剂加入到碱性的Cu2+蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸磷钨酸试剂在未被破坏之前能无效地被Cu2+蛋白质络合物所还原.

3.紫外接收法：

大多数蛋白质在280nm波利益有特征的最大接收，这是因为蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的原因，是以，利用这个特异性接收，可以计算蛋白质的含量.如果没有干扰物资的存在，在280nm处的接收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液.部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波利益有最大接收.有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校订，普通按下述公式粗略计算：

是蛋白质溶液在280nm波利益（光程1厘米）测得的光密度值.是蛋白质溶液在260nm小波利益（光程1厘米）处所测得的光密度值.

此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的.是以，对其他蛋白质和其他核酸纷歧定适用.因为各种蛋白质所含芳喷鼻族氨基酸的量分歧，是以，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变更.

所有的蛋白质在230nm以下都有强接收.例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58.在230nm以下的强接收是因为肽键的存在，是以，此值对所有的蛋白质都是一样的.从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质.蛋白质浓度可以近似地由下式得到：

光密度之差求

得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分发生的误差.但是，蛋白质之间的分子量差别比较大，是以，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校订.因为蛋白质的接收峰常因pH改变而变更，所以在建造尺度曲线时，必须与样品条件分歧.

4. Bradford比色法：

Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单敏捷.用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲零碎的干扰.

分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以0.15mmol/l NaCl补足至100µl，同时以两管100µl的0.15mmol/l NaCl作空白对照.每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟.用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对尺度蛋白浓度作图，画尺度曲线，并测量待测样品的A595.从BSA尺度曲线中确定待测样品的浓度.测定10100µg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行.样品浓度过高，可浓缩后进行，或在10100µg另作一尺度曲线进行测定.

5．电泳估算法（我们选择此法）：

样品倍比浓缩，SDSPAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度.

以提取癌组织总蛋白为例：

① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗濯3次，目的是去除样本中的血液.

② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，坚持在4℃条件进行.

③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化.再加入0.5ml βME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；

④ SDSPAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度.

二、SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）

A：实际操纵

1. 做胶前的筹办

1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子.

2)检查是否有新颖的，充足10%APS，没有立刻重配.

3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量.

2. 制胶，电泳

1）装好架子.

2)按照上面配方配制分离胶.(单位：ml，Total： 8ml)

7.5％ 10％ 15%

2×Sep. buffer 4 4 4

4

ddH2O 0

TEMED 8ul

8ul 8ul

10%APS 80ul 80ul 80ul

在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集.

3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶.(单位：ml，Total： 3.5ml)

3％

2×Stacking. buffer

ddH2O

TEMED 5ul

10%APS 50ul

倒好后拔出事后筹办好的梳子.

4)待胶凝集好后，上样，电泳. 上层胶用6080V电压，当样品至分离胶时，用100120V电压.普通电泳时间在1.5小时摆布.

B ：留意事项及常碰到的成绩 1）分离胶不要倒的太满，须要有必定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩后果.

2）上样蛋白量不该超出30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) .

3）gel通常在0.51h内凝集最好，过快暗示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶.太慢则说明两种试剂用量不敷或者零碎实际不纯或实效.

4）混合搅拌速度太快发生气泡影响聚合，导致电泳带畸形.太慢不均匀，特别是甘油.

5）电泳中常出现的一些景象：

︶ 条带呈笑容状，缘由：凝胶不均匀冷却，两头冷却欠好.

︵ 条带呈皱眉状，可能是因为安装分歧适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完整.

拖尾：样品溶解欠好.

纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒.

条带偏斜：电极不服衡或者加样地位偏斜.

条带两边扩散：加样量过多.

三、转移

在电流的感化下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上.

膜的选择：印迹中经常使用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等.我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，和具有更好的化学兼容性.有两种规格：ImmobilonP（0.45um）和ImmobilonPSQ(0.2um for MW<20kDa).

A 半干法

即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的后果.因为电流直接感化在膜胶上，所以其转移条件比较严格，但是其转移时间短，效力高.

1 实验条件的选择

电流1mA2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整.

目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间(h)

80140 8%

2580 10

1540 12

<20 15

2 实验操纵

（1）滤纸和膜的筹办 (在电泳结束前20分钟应开始筹办工作).

A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制.

B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜.

C. 将膜泡入甲醇中，约12分钟.再转入transfer buffer中.

D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中.

（2）转移

A. 在电转移仪上铺好基层滤纸.普通用三层.

B. 将膜铺在靠膜滤纸上，留意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，坚持膜的湿润.

C. 将胶剥出，去掉stack gel，当心的移到膜上.

D. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标识表记标帜出胶的地位.

E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上. 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸.

F. 装好电转移仪，根据须要选定所需的电流和时间.

G. 转移过程中要随时观察电压的变更，如有异常应及时调整.

靠胶滤纸

胶

膜

靠膜滤纸

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westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤

Western blot原理及步骤。

Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。本文将介绍Western

blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。

一、原理。

Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。

二、步骤。

1. 样品制备。

将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。

2. 凝胶电泳。

将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。

3. 转膜。

将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。

4. 封闭。 将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。

5. 抗体孵育。

将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。

6. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。

7. 二抗孵育。

将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。

8. 洗涤。

用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。

9. 检测。

通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。

总结。

Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。

Western Blot原理、显色分类及操作步骤

Western Blot原理、显色分类及操作步骤

Western Blot原理、显色分类及操作步骤(2008-08-14 23:07:59)

标签：western blot 显色 教育

一、 原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。

western显色的方法主要有以下几种：

i.

放射自显影

ii. 底物化学发光ECL

iii. 底物荧光ECF

iv. 底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

二、操作步骤：

(一) 配胶

1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

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蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用适当的裂解液。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝胶配制

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳 i. 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii. 灌胶与上样

（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）

（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

Western-Blot-原理和操作方法(全)要点

Western-Blot-原理和操作方法(全)要点

Western Blot 原理和操作方法（全）

工作原理

蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.

SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.

PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.