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Northern blot 分析

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Northernblot分析

RNA的提取和电泳

（1）RNA的提取：以休眠解除不同时期的花芽为植物材料，采用Aidlab的EASYspinPlus

植物RNA快速提取试剂盒分别提取不同时期花芽的总RNA。

（2）制胶：将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。称取0.5g琼脂糖，置于干净的

烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热融化均匀。待胶凉至60-70℃时，依次向其中加

入9ml甲醛、5ml10×MOPSbuffer和0.5μlEB，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。

（3）RNA样品缓冲液：去离子甲酰胺50%，甲醛5%，10×MOPS1%，EB（1mg/ml）1%。

（4）样品制备：取DEPC处理过的500μl离心管，将每个样品25μg左右的RNA沉淀

溶于30μlRNA样品缓冲液中，将离心管置于65℃水浴中保温10min，再置于冰上5min；

每管中加入3μl甲醛凝胶加样缓冲液，混匀。

（5）上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高

出胶面1-2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样

孔。

（6）电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于3-4V/cm的电压下电泳3-4h，当

溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。

试剂配制：

（1）10×MOPS缓冲液：200mMMOPS；50mMNaAc；10mMEDTA；调pH值为7.0，

过滤灭菌后，避光保存。

（2）甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油；1mMEDTA（pH8.0）；0.25%(m/v)溴酚蓝；0.2mg/ml

溴化已锭

（3）RNA样品缓冲液：10%10×MOPS缓冲液；17%甲醛；45%去离子甲酰胺

转膜及烘膜

（1）按胶块大小剪取膜一张，剪去膜一角，在DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡

至使用时取出。

（2）变性胶用DEPC水轻摇漂洗10min×3次，将胶块切去一角，并在20×SSC中浸泡

15min×2次。

（3）用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放在大的干烤皿上，上面放一

张Whatman3MM滤纸，倒入20×SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸

湿透后，用玻璃棒赶走所有气泡。将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM

滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。

（4）用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。

在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。将三张已湿润的、与凝胶

大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与膜之间的气泡。

（5）将一叠（5-8cm厚）略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上

方放一块玻璃，然后用一个重约500g的重物压在玻璃板上，其目的是建立液体自液池经凝

胶向膜上行的流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。

（6）使上述RNA转移持续进行15h左右。在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应及时更换

新的纸巾。转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，将凝胶置于紫外灯下，观察

凝胶上有无残留的RNA。

（7）将膜在5×SSC中浸泡5min，以去除膜上残留的凝胶。

（8）吸去多余的溶液，将膜放于干滤纸上，RNA面向上，254nm（1.5J/cm2）UV交

联4min；80℃，干烤0.5—1h，直接用于杂交或用塑料袋密封，4℃保存备用。探针的合成

（1）各个时期RNA的基因组DNA的去除。

（2）第一链cDNA的合成（M-MuLVReverseTranscriptase，NEB）

A．按照核酸测定仪测定的RNA浓度，每个样品取出2μg总RNA。

B．在无RNase的离心管中加入以下试剂：

C．70℃，加热5min，短暂离心后，置于冰上。

D．混合下列样品：

E．42℃，温育1h。

F．95℃，加热5min，使酶失活。

G．所得即为第一链cDNA，-20℃保存备用。

（3）目的片段的获得：

A．利用Primer-Primer5.0软件设计合适的引物（表3-1）。

B．目的片段的扩增：以休眠解除期总RNA反转录得到的cDNA为模

板，扩增差异基因的目的片段。PCR体系及反应条件如下：

PCR反应体系：

C．目的片段的回收：按照玻璃奶回收试剂盒（博大泰克公司）说明书进行。

D．探针标记：采用随机引物标记法，按照Primer-a-GeneLabelingSystem说明书进行，分

别标记差异基因的目的片段。

具体步骤如下：（1）在1.5ml离心管中分别加cDNA片段的第二次PCR产物5μl（约25ng），加ddH2O

27μl，混匀。煮沸10min，立即放于冰上。

（2）向离心管中加入以下试剂：

dNTP（ATP，GTP，TTP）（2.5mMeach）2μl

5×Labelingbuffer10μl

100×BSA2μl

Klenow-enzyme（5U/μl）1μl

混合均匀，置于冰上。

（3）在杂交室中，加入[α-32P]-dCTP（μCi）3μl，混合均匀，25℃水浴2h。

（4）沸水中煮沸10min，冰浴5min，探针合成完毕。

预杂交：

A.将干燥好的尼龙膜分别置于杂交管中，点有PCR产物的一面朝向管心，用稀释好的

5×SSC润洗膜。

B.鲑精DNA的变性：将10mg/ml的鲑精DNA，沸水中煮沸10min，冰浴10min。

C.将变性好的鲑精DNA加入杂交液中。

D.倒掉杂交管中的5×SSC，并向各个杂交管中加入30ml杂交液，杂交炉中，65℃，杂交

过夜。

杂交：

A.预杂交结束后，加入标记好的探针到杂交液中。（避免直接将探针加到膜上，轻柔的混匀。）

B.杂交炉中，65℃，杂交24-36h。

洗膜：

A.打开杂交炉，将温度降到42℃.

B.取一80ml离心管，收集探针。

C.加入一定量的洗膜液Ⅰ，42℃，洗膜10min。

D.倒掉洗膜液I，加入一定量的洗膜液Ⅱ，42℃，洗膜8min。

E.将膜摇晃至管口，检测管口信号强弱。若信号较强，再用洗膜液Ⅱ重复洗膜一次，5min。

F.取出膜，用滤纸吸干表面的溶液。

放射自显影：

将膜放于两张保鲜膜之间，磷屏压片1-2d，扫描，观察杂交结果。

试剂配制：

（1）20×SSC:3MNaCl；0.3M柠檬酸钠.2H2O；用浓盐酸调pH值为7.0，灭菌。

（2）杂交液：1×Denhardt’s；5×SSC；0.2%SDS；0.05MPB（磷酸缓冲液）；0.1mg/ml鲑精

DNA（ssDNA）

（3）洗膜液Ⅰ：2×SSC；0.2%SDS

（4）洗膜液Ⅱ：0.2×SSC；0.2%SDS

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Northern blot技术

Northern blot技术

核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）

（一）Southern Blot 原理：

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…

（一）Southern Blot

原理：

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

（二）Northern Blot

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

（三）探针标记技术

1 标记物：放射性和非放射性两种

放射性：

非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 2、标记方法

（1）切口平移法

（2）随机引物法

（3）末端标记法

（4）单链DNA探针标记

（5）寡核苷酸探针标记法

northern blot

简介

Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。

Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学James

Sourthern blot和Northern blot原理

Sourthern blot和Northern blot原理

Sourthern blot和Northern blot原理

（一）Southern Blot

原理：

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定 后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自 显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。

DNA => 琼脂糖电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） => 洗膜 =>

放射自显影或显色

（二）Northern Blot

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

mRNA提取 => 甲醛变性电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） => 洗膜 => 放射自显影或化学发光

（三）二者异同

Southern blot 是分析DNA的杂交技术，Northern blot是分析RNA的，而Western

blot是分析蛋白质的

Southern 和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程上也有区别，主要是

Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；

Southern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解

（四）探针标记技术

1 标记物：放射性和非放射性两种

放射性：

非放射性：生物素、地高辛素、荧光素

Northern Blot原理及实验方法

Northern Blot原理及实验方法

Northern Blot原理及实验方法

发布日期：[2012-9-6] 共阅[41388]次

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

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实验方法：

[仪器、试剂、材料]

（一）仪器

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。

（二）材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜

（三）试剂

NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。

[方法与步骤]

1. 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水(2 L)备用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3．制胶：

1． 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)

2． 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。

注意尽量避免产生气泡。

NORTHERN BLOT基本概述

NORTHERN BLOT基本概述

NORTHERN BLOT基本概述

一、目的

学习NORTHERN BLOT技术，通过本实验了解NORTHERN BLOT的应用

二、概述

Northern blot的基本概述是将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移至尼龙膜等固相膜载体上，用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性结合杂交信号，经放射自显影或现色反应，对杂交信号进行分析。

将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。

三、试剂及材料

1. 水平电泳仪及电泳槽

2. 制冰机

3. 恒温水浴箱

4. 凝胶成像系统

5. EP管、移液器及Tip头

6. 5×MOPS电泳buffer （0.2M MOPS pH 7.0, 0.25NaAc,5mM

EDTA ）

7. 甲醛凝胶加样buffer （1mM EDTA, 0.25%溴酚蓝,50％甘油） 8. EB

9. DIG标记EGFR探针

10.DIG Easy Hyb工作液

11.20×SSC （3mol/L NaCl, 0.3mol/L 柠檬酸钠,用1mol/L HCl

调节pH 至7.0）

12.鲑精DNA10mg/ml）

四、操作步骤

（一）、RNA转移与固定

1. 变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝胶片刻，10×SSC中浸泡平衡凝胶30min。

2. 按southern blot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。

3. 1×SSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。

4. RNA染色，干燥的尼龙膜先于5％冰乙酸中室温浸泡15min。后于0.5mol/L乙酸钠和0.04％亚甲蓝溶液中浸泡5-10min.去离子水淋洗膜5-10min，可见RNA标准及28S及18SRNA的条带，软铅笔标记。