重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究

L act ococcus l act i s subsp．1a ct i s I Ll403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究张天萌，沐万孟，江波。

，张涛，倪靓霞(食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122)摘要：谷氨酸脱羧酶(G A D)是功能因子y-氨基丁酸(G A B A)生物合成过程中的重要酶。

为了得到一种有高效活性的G A D基因工程茵，克隆到一种G A D基因，来源于微生物Lac t ococc us l ac—t i s s ubsp．1a ct i s I I．1403。

以pE T-22b(+)为载体质粒，E sche r i chi a col i B L21(D E3)为宿主细胞，构建了基因重组菌，I P TG可诱导目的重组G A D过量表达；经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行S D S—PA G E分析，在约54000处出现显著的特征蛋白质条带；活性检测结果表明。

该重组G A D的转化活性比野生菌株有明显提高，野生菌株经5h细胞转化，反应底物转化率为55．8％，而工程菌20m i n后转化率达到82．1％，30m i n后转化可达到98．3％。

关键词：谷氨酸脱羧酶；7-氨基丁酸；克隆表达；亲和层析；细胞转化中图分类号：Q78文献标志码：A文章编号：1673—1689I2012)03—0302--05C l oni ng，Expr ess i on，Pur i f i cat i on and C har a ct e r i za t i on of G l ut am at eD ecar boxyl as e f r om L act ococcus i act i s subs p．1ac t i s I Ll403Z H A N G T i an—m eng。

M U W an—m en g，J I A N G B o’，Z H A N G T oo，N，L i ang—xi a(S t a t e K e y L aborat or y o f F oo d Sci e nce and T echnol ogy，J i angnan U ni ver s i ty，W uxi214122。

大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶定点突变及其酶学性质初步研究摘要：大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶（L-GAD）是一种关键的酶，在生物体内催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）。

本研究旨在通过定点突变技术对L-GAD进行改造，进而研究突变体的酶学性质。

通过大肠杆菌基因工程技术定点突变D479的临氨酸残基，获得了突变体L-GADD479A。

本研究分别对野生型和突变体L-GADD479A进行了比较分析。

引言：L-GAD是多种生物体内的关键酶之一，具有重要的生理功能。

通过催化L-谷氨酸转化为GABA，L-GAD参与了神经递质的合成以及神经元的抑制传递过程。

近年来，通过对L-GAD的研究，发现L-GAD的活性和稳定性可以通过定点突变来改变。

其中，D479位点在突变中被广泛注目。

材料与方法：将L-GAD的基因克隆至大肠杆菌系统，通过PCR扩增获得谷氨酸酶基因片段。

使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit在L-GAD基因的D479位点引入一个临氨酸突变，得到突变体L-GADD479A。

将野生型和突变体经过诱导表达，然后通过Ni-NTA亲和柱纯化获得纯化的L-GAD酶，利用SDS-PAGE进行酶的纯度鉴定。

结果：通过PCR扩增获得了L-GAD基因片段，通过定点突变技术成功将D479位点的天冬氨酸突变为临氨酸。

纯化的野生型和突变体L-GAD经SDS-PAGE分析得出纯度良好。

进一步的酶学性质研究表明，突变体L-GADD479A的酶活性相较于野生型L-GAD下降了20%。

此外，在pH 7.5下，野生型和突变体酶的酶活性最高，而在pH 3.0和pH 9.0时，酶的活性明显下降。

突变体L-GADD479A的热稳定性较野生型L-GAD提高了5℃，更能适应高温条件。

讨论：本研究通过定点突变技术成功地构建了突变体L-GADD479A，并对其酶学性质进行了初步研究。

突变体L-GADD479A在酶活性和热稳定性方面与野生型存在显著差异。

谷氨酰胺转氨酶发酵工艺优化及其酶学性质王兴吉;刘文龙;郭庆亮;张杰【摘要】[Objective]To investigate the optimum fermentation conditions of TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 and explore the enzymatic properties of TGase.[Method] L9(34) orthogonal design on media and culture conditions of Streptomyces lanceolata were optimized.[Result]The best medium:Na2HPO4 2.0 g/L,MgSO4 · 7H2O 1.5 g/L,KH2PO4 2.5 g/L,CaCl2 3.0 g/L.The optimal culture conditions:culture temperature 30 ℃,bottling capacity 25 mL,agitation rate 200r/min,inoculums size 10％.The produced TGase exhibited optimum activity at 50 ℃ and pH 6.0.It was stably incubated in 40 ～60 ℃ for 30 min and the remained enzyme activity was above 85％ dealed with pH 5.0 ～7.0 for 30 min.The enzyme was strongly inactivated byFe3+,Cu2+,Zn2+.[Conclusion] TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 has good acid resistance and heat resistance,and which has broad prospects in commercial production.%[目的]研究茂源链霉菌LD195产TGase 的最佳发酵工艺条件,并探讨TGase的酶学特性.[方法]采用L9(34)正交试验对产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株培养基和培养条件进行优化.[结果]最佳无机盐配方为Na2 HPO42.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO4 2.5 g/L,CaCl2 3.0 g/L,最佳培养条件为培养温度30℃,装液量25mL,摇床转速200 r/min,接种量10％.该谷氨酰胺转氨酶的最适反应温度为50℃,在40～60℃条件下保温30 min酶活基本没有损失;最适反应pH为6.0,在pH为5.0 ～7.0条件下保存30 min仍具有85％以上酶活;同时Fe3+、Cu2+、Zn2+会强烈抑制酶的活性.[结论]茂源链霉菌LD195产TGase具有良好的耐酸性和耐热性,在商业化生产中具有广阔前景.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2017(045)032【总页数】4页(P161-164)【关键词】培养基;茂源链霉菌;谷氨酰胺转氨酶;酶学性质【作者】王兴吉;刘文龙;郭庆亮;张杰【作者单位】山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400;山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400;山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400;山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400【正文语种】中文【中图分类】S188谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase.EC2.3.2.13,TGase)，又称转谷氨酰胺酶(TGase)，是一种催化酰基转移反应的转移酶，是由331个氨基组成的分子量约38 000的具有活性中心的单体蛋白质，可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间共价交联[1-2]，从而改善蛋白质的结构和功能，影响蛋白质的性质，如发泡性、乳化性、乳化稳定性、热稳定性、保水性和凝胶能力等，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等，目前已经被广泛应用于食品工业。

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸条件的优化陈琳;张充;吕凤霞;别小妹;赵海珍;陆兆新【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2015(036)001【摘要】研究重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的适宜条件.检测温度、pH值、表面活性剂、金属离子、底物与菌体质量比以及反应体系体积对GABA转化效率的影响.结果表明:最优转化条件为:转化体系5mL、底物L-谷氨酸钠浓度0.1 mol/L、重组大肠杆菌细胞6.4 mg(干质量)、Triton-100体积分数0.06％、Ca2+浓度0.6 mmol/L,转化温度45℃、反应体系pH 4.5.在该体系下反应7h,GABA合成量达到26.1 g/L,GABA转化效率在1h时达到最高,为13.8g/(g·h),较优化前提高1.5倍.【总页数】6页(P158-163)【作者】陈琳;张充;吕凤霞;别小妹;赵海珍;陆兆新【作者单位】南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京210095;南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095【正文语种】中文【中图分类】Q939.9【相关文献】1.响应面法优化重组大肠杆菌生物合成别藻蓝蛋白(holo-apcA)的发酵条件 [J], 周孙林;陈华新;姜鹏;李富超;唐东山2.重组谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的工艺条件优化 [J], 黄燕;宿玲恰;吴敬3.响应面分析法优化重组大肠杆菌生物合成谷胱甘肽的条件 [J], 廖鲜艳;朱至;陈坚;堵国成4.重组大肠杆菌合成左旋多巴条件的优化 [J], 李华钟;孙伟;王树英;陈坚5.重组大肠杆菌产乙酰乳酸合成酶发酵条件优化 [J], 赵婷;黄礼清;金紫阳;袁思棋;刘君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组草酸脱羧酶的表达及酶学性质研究林日辉;许丽莉;农勉;张陆成【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2011(037)002【摘要】研究了重组草酸脱羧酶的表达及其酶学性质.经IPTG诱导,每克湿重菌体收获草酸脱羧酶活力820U,经Ni-NTA亲和层析酶液纯化2.07倍,酶活力回收60.38%.酶促反应的最适温度为50～55℃,最适pH值为3.5,添加EDTA及Fe2+对酶活力有促进作用,Mn2+抑制酶活.在pH4.0,温度37℃下Km值为14.53 mmol/l,Vmax为133.33 U/mg.【总页数】5页(P57-61)【作者】林日辉;许丽莉;农勉;张陆成【作者单位】广西民族大学化学与生态工程学院,化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室,广西南宁,530006;广西民族大学化学与生态工程学院,化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室,广西南宁,530006;广西民族大学化学与生态工程学院,化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室,广西南宁,530006;广西民族大学化学与生态工程学院,化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室,广西南宁,530006【正文语种】中文【相关文献】1.重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究 [J], 范恩宇;黄俊;胡升;梅乐和2.重组草酸脱羧酶的表达及诱导条件优化 [J], 韦成昱;林日辉∗;梁跃;龙寒;禤金彩3.短小芽孢杆菌LC01漆酶基因在毕赤酵母中的胞外表达及重组漆酶酶学性质研究[J], 李成名;王佳懿;卢磊4.来源于Laceyella sp.的α-淀粉酶基因克隆、重组表达及酶学性质研究 [J], 赵海燕;宋晨斌;刘正亚;马兴荣;尚会会;李安华;关现军;王建设5.组蛋白赖氨酸特异性脱甲基酶在大肠杆菌中的重组表达及酶学性质研究 [J], 李金荣;辛瑜;石贵阳;顾正华;张梁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成Y-氨基丁酸条件的优化(南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095)摘要:研究重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成、Y-氨基丁酸(y-aminobutyric acid GABA)的适宜条件。

检测温度、pH值、表面活性剂、金属离子、底物与菌体质量比以及反应体系体积对GABA转化效率的影响。

结果表明:最优转化条件为:转化体系5 mL、底物L-谷氨酸钠浓度0. 1mol/L、重组大肠杆菌细胞6.4mg(干质量)、Triton-100体积分数0.06%。

Ca2+浓度0.6mmol /L，转化温度45℃、反应体系pH4.5。

在该体系下反应7 h, GABA合成量达到26.1 g/L, GABA转化效率在1h时达到最高，为13.8 g/ <g.h)，较优化前提高1.5倍。

关键词:Y-氨基丁酸;谷氨酸脱羧酶;转化条件;优化Y-氨基丁酸（y-aminobutyric acid GABA)是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质。

GABA具有许多重要的生理功能，如降血压[1}、预防癫痫[2]、抗抑郁[3]、抗疲劳[4]l、控制哮喘[5]和促进激素分泌等。

山于GAGA具有诸多重要的生理功能，已经发展成为一种新型的功能性因子，正逐渐被广泛应用于食品保健、医药、化工及饲料[6]等领域。

目前，国内外都在积极研发富含GAGA的食品，己成功研发的有茶饮料、米胚芽、功能性饮料、乳制品和大豆发酵制品[7-9]。

微生物法制备GAGA的优点很多，如安全性较高、反应条件温和、生产成本较低以及较好的商业化开发应用前景等，因此，近年来微生物法制备GAGA受到国内外学者广泛的关注，其中大肠杆菌、红曲霉、酿酒酵母、乳酸菌等GABA生产菌种研究较为深入。

已有很多研究证明乳酸菌具有合成GAGA的能力[10-13]，乳酸菌作为一种有保健作用的益生菌，用其合成GAGA越来越受到人们的青睐，目前用乳酸菌合成GAGA的研究主要集中在菌株的筛选、传统诱变方法以及发酵条件优化上，但是，山于乳酸菌具有发酵周期较长以及培养条件较难制等缺点，在生产强度上处于劣势，而借助基因工程手段构建高拷贝重组质粒，导入宿主菌，可以使谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)表达量提高，获得高GAD活性的基因工程菌，从而缩短生产周期，提高生产强度。

中山大学硕士学位论文谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达姓名：***申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：***20070608半醛（ｓｓＡ）和谷氨酸，然后ＳＳ＾在琥珀酸半醛脱氢酶（Ｓｕｃｅｉｎａｔｅｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，简称ＳＳＡＤｒＩ）氧化下形成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和谷氨酸脱羧酶（ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＥＣＡ．１．１．１５）催化的谷氨酸脱羧反应一起，构成了Ｙ一酮戊二酸氧化形成琥珀酸的另一条支路（Ｓｔｒｅｅｔｅｒｅｔａｌ，１９７２），称之为ＧＡＢＡ支路（如图１—１、卜２）。

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镕，ｌｇｔ鬻Ｙ－－黧—整鏊麓—㈨谷氯缒Ｉ；Ｉ舔氮毅脱羧醮ｌ‘ｌｌ置蔽联镛拜）骧期蘸辅ｉ跷了一氮蕊Ｔ馥’ｔｉｌ｝泓繁氟酶廷勰索酸—４琥珀麓≮器萄瑟甄萄嚣基毒嘲酸拳蒸图１－１：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＦｉｇ．１·１：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩ图１－２：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＩＦｉｇ．１—２：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩＩ１．２．１ＧＡＢＡ的生理功能（１）改善脑机能，延长记忆力。

研究表明，ＧＡＢＡ可以提高葡萄糖磷酯酶的活性，从而促进动物大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能。

（２）改善视觉功能。

据报道，将带有毛细管的电极插入老年猴子的大脑视觉神经皮层中，通过毛细管给神经细胞注入微量的ＧＡＢＡ。

比较给药前后视觉神经细７马倩中山大学硕士学位论文ＧＡＤ６７３４８８ｂｐ图．２．７ＧＡＤ６７的基因结构分析Ｆｉｇ．２·７ＴｈｅｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＡＤ６７马倩中山大学硕士学位论文细菌表达载体ｐＱＥ３０由本室保存。

物理图谱见图３—２。

ｐＱＥ－３０，ｐＱＥ·３Ｔ，ａｎｄｏＱＥ－３２ＶｅｃｔｏｒｇＰｏｓｉｔｉｏｎｓ研’ｅｌｅｍｅｎＩｓｉｎｂａｓｅｓ“ｐＱＥ·３０割０Ｅ－３１ｐＱＥ－３２Ｖ＊ｃｔｏｒ赫｛ｂｐｌ３４６１钍醴＋泓６２跏一ｏｆｎｕｍｂｅｒｉｎｇ耐热ｏｌ（ＣＴＣＧＡＧ）１蠢１－６ｌ毒Ｔ５ｐｒｏｍｏ栅／ｌａｃｏｐ烈司垂ｃ盱ｄｅｍｅｎｔ７－－８７瑚７７迎７ｒＴ５ｔｒｏｒ％ｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｄ＂６１６１６ｌ６】ｃＨｉｓ－ｔａｇ∞ｄｉｎｇｓｅｑｕｅｍ：枣１２７—１４４他７－１钳１２７－ｔ４４Ｍｕｌ矗ｐｌｅｃ｜ｏｎｉｎｇ钳翻ｅ１４５一１９２１４７－１９４１４｛缸１９３ｈｂ如，Ｂ细ｎ５ｃ打ｐ如ｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ理赫２０８－－３０２２１０．－３０４２０９－３０３咖８Ｔ１ｔｍｎｓｃｎ两ｏｎａｌｈ冀啊瞄抟ｃｌ｜；ｏｒｒｆｅ叠ｉｏ“１０６４－１１６２１０６６＿１１６４１０６．孓．１１６署Ｃｏｌ￡１ｏ南ｉｎｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｍｎ１６３０１６４０１６３９参｛ｑ馥确瞅ｃｏｄｉｎｇｓｅｑ臼ｅｎｃ邑零２Ｓ垂－２３９６９２５＆－２３９８嚣２５７卫３９７叠竺‰燃盛驺§隔∞啼‘图３－２ｐＱＥ３０载体物理图谱、多克隆位点及测序引物占Ｆｉｇ．３－２Ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｏｆｐ０Ｅ３０ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐ一ｍｄｌ＇ｓ。

重组草酸脱羧酶的表达及诱导条件优化韦成昱;林日辉∗;梁跃;龙寒;禤金彩【摘要】本文研究了枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的重组草酸脱羧酶的诱导表达,并对诱导条件进行了优化。

结果表明,重组草酸脱羧酶的最佳诱导表达条件为：发酵液初始 pH 8.0,诱导时机为3 h,添加 IPTG 0.4 mmol/ L,MnCl26 mmol/ L,诱导表达10 h,在此条件下每升发酵液产草酸脱羧酶960 U。

% The optimized inducing condition of recombinant oxalate decarboxylase derived from Bacillus subtilis was studied. The results showed that 960 U oxalate decarboxylase per liter was induced under the conditions as follows: initial pH at 8. 0, the recombinant strain was induced by adding 0.4 mmol/ L IPTG and 6 mmol/ L MnCl2 after 3 h, and cultured for 10 h.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】5页(P218-222)【关键词】草酸脱羧酶;诱导表达;优化【作者】韦成昱;林日辉∗;梁跃;龙寒;禤金彩【作者单位】广西民族大学海洋与生物技术学院，广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006;广西民族大学海洋与生物技术学院，广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006;广西民族大学海洋与生物技术学院，广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006;广西民族大学海洋与生物技术学院，广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006;广西民族大学海洋与生物技术学院，广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006【正文语种】中文草酸(HOOC-COOH)是自然界中酸性最强的有机二元酸，它能溶于水和乙醇，不溶于乙醚，通常由植物、微生物通过水解草酰乙酸或氧化乙醛酸、抗坏血酸产生［1］。

专利名称：一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用
专利类型：发明专利
发明人：倪晔,章凯
申请号：CN201310367673.6
申请日：20130822
公开号：CN103421734A
公开日：
20131204
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用，属于酶工程技术领域。

本发明公开了一株重组表达短乳杆菌酪氨酸脱羧酶TDC的基因工程菌BL21(DE3)/pET24-TDC，该基因工程菌的构建方法，高表达可溶性TDC的方法，及该酶的应用。

将TDC编码基因连接表达载体并转入大肠杆菌表达宿主，通过在发酵培养基中添加葡萄糖显著提高了重组TDC（rTDC）的可溶性表达，蛋白产量达到224mg/L发酵液。

采用Ni柱纯化C端带有His-Tag的rTDC，回收率90%。

rTDC对于底物L-酪氨酸的比酶活为133.5U/mg。

本发明的重组表达可溶性rTDC的方法具有表达水平高、纯化简单、回收率高、成本低等优点，可用于制备酪胺、多巴胺以及帕金森病的治疗研究。

申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院
国籍：CN
代理机构：无锡市大为专利商标事务所
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