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文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录样品相关信息 基本信息主要仪器设备和试验耗材信息 主要使用的仪器设备 试验用培养基 试验用试剂 试验用菌种 试验环境 无菌室 洁净工作台 生物安全柜 试验方案 验证试验目的微生物限度检查方法草案 方法验证试验菌液制备计数培养基适用性检查控制菌检查用培养基使用性检查 供试液制备 方法验证菌落计数方法验证试验 控制菌检查方法的验证方法验证结论供试品微生物限度检查结果 样品相关信息 基本信息（三批）1 1.12 2.1 2.2 2.3 2.4 3 3.1 3.2 3.3 4 4.1 4.25 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.15.5.2 5.6 6 1 1.12主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备2.2试验用培养基2.2.1对照培养基2.2.2试验用培养基2.3试验用试剂2.4试验用菌种3试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
3.1无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
3.2超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录3.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录4试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过lOOOcfu,霉菌和酵母菌总数不得过lOOcfu，大肠埃希菌不得检出。
食品平安是全球关注的焦点根据世界卫生组织的估计，全球每年发生食源性疾病数十亿人。
兴旺国家(包括美国)发生食源性疾病的概率也相当高，平均每年有1／3的人群感染食源性疾病。
这说明，工业化程度的兴旺并不能保证食源性疾病爆发危险性的降低，反而由于工业化程度越兴旺，食物供给链越难控制，一旦发生食品平安问题，其影响面和涉及面会更大。
另一方面，由于工业化产品的规模大，不平安食品的召回、销毁所带来的经济损失也会更大。
也就是说，每年由数十亿例食源性疾病而导致的医疗费增加，以及产品的销毁可带来数十亿美元的消耗。
由此可以看出，食品平安对社会、对经济的影响是非常大的，在食品平安不良的条件下，儿童、孕妇、年老体弱者和免疫力低下的人群更容易感染食源性疾病，成为最主要的受害人群。
食品平安被列为公共卫生优先领域由于食品平安的现状，2001年，世界卫生大会做出了?食品平安决议?，制定了全球食品平安战略，将食品平安列为公共卫生的优先领域，同时，要求世界卫生组织各成员国制定相应的食品平安行动方案，最大程度地减少食源性疾病对公众健康的威胁，很多国家据此采取了行动，加强了食品平安工作。
美国“9．11〞事件后，世界各地对生物恐怖事件给予了极大的关注。
2002年，世界卫生组织召开专家会议，制定了“建立与强化预防和应急反响体系的导那么〞，提出了“食物恐怖〞的新概念。
“食物恐怖〞的定义为：以化学性、生物性、放射性等有害物质，蓄意污染食品，导致人群伤害或死亡，破坏社会经济或政局稳定的行动或危险。
而且特别说明，人为的污染食品可以发生在从农场到餐桌的整个食物链的任何―个环节。
所有食品，包括食品加工用水、瓶装水等都可能被恐怖分子利用为载体，威胁甚至经涉及政局的稳定。
一般的食品平安是指引起贸易纠纷，引起疾病或死亡，而“食物恐怖〞随时随地任伺环节都可能造成食物链的危害，特别是工业化的生产链。
2002年7月，我国南京发生的毒鼠强中毒事件，曾在国际会议上被列举为“食物恐怖〞事件。
微生物学教程（第四版）知识点——周德庆绪论微生物与人类一．什么是微生物1.微生物：一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称2.不是一切微生物都是肉眼不可见的。
例：费式刺尾鱼菌，大小：75μm（宽）X200~600μm（长）纳米比亚珍珠硫细菌，大小：直径100~300μm，最大750μm 3.微生物的定义：是对所有形体微小的单细胞、细胞结构较为简单的多细胞，以及没有细胞结构的低等生物的通称。
解析：形体微小：一般小于100μm结构简单：单细胞，简单多细胞，无细胞结构低等生物：进化地位低：原核生物，真核生物，非细胞生物。
微生物并非分类学术语，而是根据生物体的大小而被人为的划分在一起。
4.微生物类群：①原核生物：支原体、衣原体、立克次氏体、放线菌、蓝细菌、细菌、古菌。
（支衣立放蓝细古）②真核微生物：真菌（酵母菌、霉菌、蕈菌），原生生物（藻类、原生生物）③非细胞生物：（真）病毒，亚病毒（类病毒、拟病毒、脘病毒）二．微生物的五大共性（要考）1.个体小，面积大：比表面积大（产生其余四个共性）2.吸收多，转化快：代谢能力强3.生长旺，繁殖快4.适应强，易变异：有极其灵活的适应性或代谢调控机制5.分布广，种类多：“无孔不入，随遇而安”微生物多样性的体现①物种多样性②生理代谢类型多样性③代谢产物多样性④遗传基因多样性⑤生态系统类型的多样性三．人类对微生物世界的认识史1.史前时期：微生物感性的认识时期2.初创时期：微生物形态的认识时期列文虎克——微生物学的先驱者，首个看见并描述微生物的人。
3.奠基时期：微生物生理学发展时期巴斯德——微生物学奠基人，微生物学之父（提出胚种学说，否定了自然发生学说。
）（巴斯德消毒法、分离出引起蚕病的微生物、创立免疫学原理和预防接种方法）科赫——细菌学的奠基人，科赫原则。
（发明固体培养皿，建立分离纯化微生物的实验技术，利用平板分离法寻找并分离到许多病原菌——发现结核病原菌）3.发展时期：微生物生物化学发展时期布赫纳——生物化学奠基人，提出酶的概念费莱明——发现青霉菌产生抑菌物质—青霉素4.成熟时期：微生物研究进入分子生物学水平，成为分子生物学研究中主要对象。
一.样品的采集和处理：1.采样方法1.1采样必须在无菌操作下进行1.2根据样品种类：袋装、瓶装和罐装食品，应采取完整的未开封的样品；如果样品很大，则需用无菌取样器取样；固体粉末样品，应边取边混合；液体样品通过振摇混匀；冷冻食品应保持在冷冻状态，非冷冻食品需在0-5℃中保存。
2.样品的处理：塑料或纸盒装样品，用75％酒精棉球消毒盒盖或袋口。
二.菌落总数的测定1.检验目的和范围：对无菌操作条件下获得的样品原液配制的样品稀释液进行细菌总数测定。
本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。
2.操作程序：2.1培养基制备：1）检查预先经过灭菌处理的营养琼脂培养基是否处于正常、可用状态。
2）将灭菌培养基用电炉加热2分钟，或用水浴融化后，在40-45℃水浴中保温待用。
2.2以无菌操作将检样10mL(或g)入于含有90mL灭菌生理盐水的灭菌三角瓶中，经充分振摇后做成1：10的稀释液2.3用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，没管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液2.4另取1mL灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管2.5选择2-3个适宜的稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
2.6稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基注入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照2.7待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h2.8菌落计数的报告2.8.1平板菌落数的选择：1）选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
2）一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。
临床微生物检验是人体的各种物质进行微生物学检验，为临床诊断和治疗提供依据。
整个检验过程包括病人样品的采集、运送、处理，样品中致病微生物的分离、培养、鉴定，药物敏感试验，出具检验报告。
检验地带网为了保证检验结果准确无误，应对分析前、分析中、分析后三个阶段实行全面质量管理。
质量控制是全面质量管理内容的一部分，主要针对分析中这一阶段，通过采取各种措施来确保检验结果正确。
影响分析中阶段的因素很多，现就其主要因素和我们采取的质量控制要求分析如下：一、人员的资格及操作熟练程度由于临床微生物检验的所有试验都是中度或高度复杂的试验，其特点为①不能完全脱离手工；②以定性试验为主；③主观判断机会较多。
在操作过程的每一个环节都会出现变化，因而人的资历、专业经验、检验能力、操作熟练程度尤为重要。
CLIA 88 曾对不同实验室检验人员做出规定：中度复杂实验室的检验人员应经过训练，能进行检验，并有标本收集、合理使用仪器以及评价检验结果有效性的能力；高度复杂实验室的检验人员必须是检验专业毕业的学士、硕士或博士，是有资格的、接受过培训并能进行相应检验的人员。
国内对不同技术职称人员提出的要求是高级职称人员应掌握国内外先进技术，及时了解专业发展的前沿状况，独立解决重大关键性技术问题，有较强的处理复杂工作的能力，能正确解释检验结果的临床意义，组织参与危重病人抢救，参与会诊、技术咨询、仪器试剂的选择和论证；中级人员应熟悉同内外先进技术，及时了解专业发展的前沿状况，独立解决一些关键技术问题，有处理复杂工作的能力，能正确解释检验结果的临床意义，参与危重病人抢救、会诊、技术咨询；初级人员应了解国内先进技术、专业发展的前沿状况，在上级人员指导下解决一般技术问题，能正确解释检验结果的临床意义，参与技术咨询。
检验地带网为了保证检验质量，对接受过一定专业理论、专业技术教育与培训的上岗人员要进行定期的考核，以测试他们的检验能力及操作熟练程度。
考核的方式有多种，一种是明确地告诉操作人员，让其有思想准备；另一种是不通知对方，将考核样品混同日常检验样品作为常规工作。
考核内容可针对检验项目的某一环节。
考核样品可以是商品化的质控品，也可由实验室制备。
无论采取哪种形式，哪种样品，重要的是不得将考核样品作“特殊对待”，而应当作常规工作处理。
每个检验人员都要接受继续教育，接受新的专业理论，学习新的专业技术、掌握新型仪器的操作使用和维护，不断提高检验水平。
二、操作手册 ( 作业指导书 )检验地带网实验室应具备一本包括所有检验项目操作方法与质控方法的操作手册，由高年资人员编写。
不同级别的医院应根据各自实验室的条件与所开展项目，制定切合实际的操作手册。
编写时尽可能参照国家标准、行业标准、地方标准、国际标准、国内外参考文献中的相应部分，使方法标准化、规范化。
操作手册生成后应经室主任批准签字，注明日期，并放置在工作场所，以便翻阅。
手册中任何改变均应有科主任批准签字注明日期。
一旦科室领导更换应由现科室主任批准签字，注明日期。
停止使用的操作手册副本应保留二年后再予销毁。
作为临床微生物检验操作手册至少应包括以下内容：(1)样品采集、运送与处理， (2) 样品检验流程， (3) 检验方法与质控方法 ( 细菌分离、培养、鉴定与药物敏感试验 ) ， (4) 临床意义， (5)报告方式， (6) 仪器操作手册， (7) 试剂质量鉴定， (8) 质控控制，(9) 实验室管理的各项规章制度 ( 生物安全制度、内务管理制度、样品管理制度等 ) 。
三、仪器设备的质控临床微生物实验室最常用的仪器设备是光学显微镜、温箱、二氧化碳培养箱、冰箱与低温冰箱、压力蒸汽灭菌器等。
这些仪器设备的质量控制标准见表 1 。
表 1 临床微生物实验室常用仪器设备的质量控制仪器设备名称控制标准允许范围监控方法和频率光学显微镜每年 4 次或需要时，作清洁与调试检验地带网培养箱35 ℃ ± 1 ℃ 每天观察记录温度二氧化碳培养菌每天观察记录温度和温度35 ℃ ± 1 ℃二氧化碳浓度气体5%-10%<10%冰箱每天观察记录温度冷藏室 4 ℃± 2 ℃冷冻室-5 ℃± 1 ℃低温冰箱-20 ℃± 5 ℃ 每天观察记录温度压力蒸汽灭菌器121 ℃≥121 ℃ 使用时观察并记录温度、压力，每周用嗜热芽孢菌或每次用化学方法测试灭菌效果随着医学检验学科的不断发展，许多自动化仪器和微量生化反应系统相继进入微生物实验室。
给细菌、真菌的培养、鉴定与药敏试验带来快速准确的结果。
对于这些仪器设备的质量控制，可根据厂商说明书推荐的方法去做，确保测试系统的灵敏度和精密度。
四、培养基的质量控制用于各种临床标本中微生物分离、鉴定的培养基种类很多。
以前，都由实验室自配，现在已有成品供应。
无论成品培养基还是自制培养基，其质量好坏直接影响微生物检验结果的准确性，因此必须对培养基作以下三方面质控。
检验地带网1 ．一般性状培养基的一般性状包括外观、厚度、 pH 值等。
刚配制的液体培养基，其外观应透明、清亮、无混浊、无沉淀，颜色符合要求。
新鲜的固体培养基应具有特定的颜色，表面湿润但无水汽、平整、光洁无凹坑和气泡。
整块平板厚薄均匀，一般厚度在 3mm ，但 MH 平板的厚度不得小于 4mm 。
斜面的长度不得超过试管长度的 2 ／ 3 。
应经常观察贮存培养基的质量是否合格。
若试管内液体培养基液面降低，表明水分蒸发，培养基浓缩。
当固体培养基发生颜色改变，表面干燥，出现裂纹或边缘的琼脂与平板或试管分离时，应不再使用。
培养基的 pH 是细菌生长的重要条件之一，一般而言合格培养基的 pH 应在规定值上下 0.2 的范围内。
2 ．无菌试验新制备的培养基要按批号随机抽取一定数量的样品作无菌试验。
对于压力蒸气灭菌后倾注的固体培养基，抽样后放35 ℃ ± 1 ℃ 温箱培养 24-48h ；灭菌后经无菌操作分装的液体培养基要全部放入35 ℃ ± 1 ℃ 温箱内培养 24h ；对有些无需高压灭菌只需煮沸消毒的选择性培养基要取部分琼脂，放入无菌肉汤管培养 24h ：上述试验证实无细菌生长时才算合格。
若有细菌生长，说明培养基制备过程中已受杂菌污染，除了寻找原因外，应不再使用3 ．细菌生长试验所有的培养基在使用前除了做无菌试验外还必须做细菌生长试验以测定培养基性能是否符合要求。
要用已知的标准菌株按照 NCCLS 推荐的方法作质控。
质控所需的标准菌株分 2 种：一种是已知的可在某种培养基上生长并产生典型生物学性状的，对培养基中的某种物质产生阳性反应的菌株；另一种是用已知的不能在某种培养基上生长或对培养基中的某种物质产生阴性生化反应的菌株。
表2 列出 10 种常用固体培养基的质量鉴定标准及所需标准菌株。
无论是厂家的成品培养基还是实验室自制的培养基，都应经过上述三方面的检验才能证实其质量是否合格。
厂家应将所做的试验内容形成书面的质量鉴定送交客户保存。
实验室自行配制过程中应对上述鉴定内容有明确记载。
此外还应对培养基配制原料的性状、批号、失效期以及配制过程各个环节的操作形成记录。
表 2 12 种常用培养基的质量鉴定表 2 12 种常用培养基的质量鉴定培养基名称质控菌株ATCC 鉴定标准血平板检验地带网金黄色葡萄球菌化脓性链球菌肺炎链球菌大肠埃希菌2592319615630525922中度到大量生长生长，β - 溶血生长，α溶血生长巧克力平板流感嗜血杆菌脑膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌102111309043096生长生长生长伊红美蓝平板鼠伤寒沙门菌大肠埃希菌粪肠球菌140282592229212生长，无色到琥珀色菌落生长，蓝黑菌落，金属光泽部分抑制麦康凯平板检验地带网大肠埃希菌奇异变形杆菌鼠伤寒沙门菌粪肠球菌25922124531402829212生长，红色菌落生长，无色菌落，迁徒现象部分抑制生长，无色菌落部分抑制SS 平板鼠伤寒沙门菌14028 生长，无色菌落，有或无福氏志贺菌粪肠球菌大肠埃希菌120222921225922黑心生长，无色菌落全部抑制部分或全部抑制TCBS 平板霍乱弧菌副溶血弧菌大肠埃希菌检验地带网94591780225922生长，黄色菌落生长，蓝色菌落部分或全部抑制营养琼脂平板沙保弱平板福氏志贺菌白色念珠菌大肠埃希菌120221023125922中度到大量生长生长部分或全部抑制罗氏培养基结核分枝杆菌H37Rａ大肠埃希菌2517725922生长部分或全部抑制淋病选择性培养基淋病奈瑟菌奇异变形杆菌表皮葡萄球菌430964307112228生长部分抑制部分抑制五 . 试剂质控临床微生物实验室常用的试剂包括染色液、诊断血清以及各种生化反应试剂等。
1. 染色液质控细菌室最常用的染色液是革兰染色液和抗酸染色液。
对自制的染色液，要求将整个配制过程的操作步骤形成记录并保存。
配好的染色液应贴上写有染色液名称、配制日期、配制人的标签。
初次使用时必须用革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌标准株作质量鉴定，以证实染色液配制无误。
商品化染色液应对品牌、试剂名称、批号、存放条件、失效期。
厂家应向客户提供染色液鉴定的质量保证书。
按照 CLIA88 的规定，染色液应每周作一次质量控制。
用金黄色葡萄球菌 (ATCC25923) 。
大肠埃希菌 (ATCC 25922) 作革兰染色液的室内质控。
用结核分枝杆菌 H37Ra(ATCC 25177) 对抗酸染色液进行质量鉴定。
过期的染色液应不再使用。
2. 常用生化试剂的质控随着细菌鉴定仪和快速微量生化鉴定板条的普及，临床微生物检验常用的生化试剂种类日趋减少，对这些试剂的质控要求见表 3 。
此外应注意在用试剂在贮存时的避光、冷藏等要求，保证试剂的稳定性。
不要使用过期的试剂。
3. 诊断血清的质控诊断血清是一种重要的细菌鉴定的试剂，应从有资质的生产单位购买。
验收时必须看清生产批号、血清效价、透明度与色泽。
初次使用时应注意：工作浓度并与原用的诊断血清对照比较后再用于病人样品的测试。
试验中应注意无菌操作，避免细菌污染。
要经常检查贮存在 4 ℃ 冰箱中的各种血清，若发现混浊，出现絮状，应停止使用。
为保证血清凝集反应结果准确，应每 3 个月对血清进行一次质控。
不要使用过期的血清。
表 3 常用试剂的质量鉴定检验地带网试剂名称检验地带网阳性对照菌种阴性对照菌种监控频率凝固酶血浆金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌每天杆菌肽 A 群链球菌 B 群链球菌每周检验地带网Optochin 纸片 肺炎链球菌检验地带网每周10% 去氧胆酸钠肺炎链球菌每周三氯化铁（马尿酸钠试验）B 群链球菌检验地带网 A 群链球菌每次过氧化氢金黄金葡萄球菌 A 群链球菌每天氧化酶铜绿假单胞菌大肠埃希菌每天甲基红试剂大肠埃希菌产气肠杆菌每周VP 试剂产气肠杆菌大肠埃希菌每周三氯化铁（苯丙氨酸脱氢酶试验）奇异变形杆菌大肠埃希菌每周“ X ”因子条状物 嗜沫嗜血杆菌副流感嗜血杆菌每周“V ”因子条状物副流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌每周“ X+V ”因子条状物流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌检验地带网每周检验地带网芽管血清白色念珠菌检验地带网热带念珠菌每次六、抗微生物药物敏感试验的质控药物敏感试验是临床微生物检验的重要步骤之一。
