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膜片钳原理PPT课件

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膜片钳技术讲座幻灯

膜片钳技术讲座幻灯

1. 膜片钳技术简介


1976 年 德 国 马 普 生 物 物 理 化 学 研 究 所 Neher 和 Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电 位的同时，记录到乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh） 激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术 （patch clamp techniques）。 1980 年 Sigworth 等 获 得 10-100GΩ 的 高 阻 封 接 （Giga-seal），1981年Hamill和Neher等对该技术 进行了改进，引进了全细胞记录技术，从而使该 技 术 更 趋 完 善 ， 1983 年 10 月 ， 《Single-Channel Recording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里 程碑。

内向电流（Inward current） 从细胞外进入细胞内的正离子（如Na+ ）电流或从
细胞内流向细胞外的负离子（如Cl-）电流。

外向电流（Outward current）
从细胞内流向细胞外的正离子（如K+）电流或从细
胞外流向细胞内的负离子（如Cl-）电流。
3. 膜片钳系统中的电阻
膜电阻（Membrane resistance, Rm） 指脂质双分子层的跨膜电阻，反映离子是否容易 穿透细胞膜。在细胞膜离子通道关闭时， Rm很大， 可达几百MΩ。不同于膜电容， 各种细胞的Rm 变异 较大。 膜输入阻抗（Membrane input resistance, Rin） 对 Rm 的测量是通过对膜输入阻抗的测量间接得到 的。给细胞膜施加一系列刺激方波，测定跨膜电流， 根据欧姆定律即可求出Rin 。注意要在形成全细胞记 录时测定，在形成高阻封接时， Rin =Rseal。

膜片钳patch-clampppt课件

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钠通道的分类 根据对钠通道阻滞剂TTX和µconotoxin (µCTX)的敏感性不同分为3类： （1）神经类钠通道：对TTX敏感性高，而对µCTX敏感 性低。 （2）骨骼肌类钠通道：对TTX和µCTX敏感性均高。 （3）心肌类钠通道：对TTX和µCTX敏感性均低。
心肌钠通道，激活所需要的电压高、失活速度快、 引起动作电位（action potential, AP）的0期去极化 。
三、离子通道的分子结构及门控机制
1．电压门控离子通道的分子结构 钠、钙和钾电压门控通道在分子结构上有许多相似之处，离
子通道蛋白是多亚基（subunits）构成的复合体。其中，构成孔道部 分的是α亚基。各种电压依赖的离子通道的α亚基均在膜上形成四个 跨膜区（D1-D4）,钠、钙通道的四个跨膜区由共价键连接成四倍体 位于同一肽链，整个亚基只有一个N-末端和一个C-末端。钾通道的 α亚基只有一个跨膜区，功能性钾通道是四个α亚基由非共价键连接 而成的四聚体。每个跨膜区由6个呈α螺旋式的跨膜片段 （transmembrane segmants, S1-S6）及其间的连结肽链所组成。连接 S5-S6的肽链部分贯穿于膜内，是形成亲水性孔道而有选择性地让离 子通过的部分，称为孔道区（pore region）或P区。另一个重要的肽 段是S4 , S4共带4～8个正电荷，当膜电位变化时，S4螺旋构型即发 生变化，通道开放，故S4被称为电压门控性离子通道的电压感受器 （voltage sensor）。
2．内向整流钾通道的分子结构
具有内向整流性钾通道，主要指KIR，KACh， KATP等，他们与Kv通道一样由4个α亚单位对称 排列而成，但每个α亚单位只有2个跨膜螺旋片 段（M1和M2），两者由H5连接。
3.离子通道的门控机制
电压依赖性钠通道受膜电位的影响，在 不同电压影响下，通道蛋白发生构象变 化而使通道不断转换于静息态（resting state）、开放状态（open state）和失活 状态（inactive state）。

膜片钳与ltp-ppt课件

膜片钳与ltp-ppt课件

LTP原理
电生理记录上反映为EPSP 或EPSC幅度的增加，即 LTP。
2211
记录电极
~
海马脑片LTP
海马脑片上电极的放置
2222
大鼠体重：180-240g
在体LTP
刺激电极: 采用针灸针，多为 双极电极 定位坐标(mm)：AP 8，LM 4， DV 3.2-3.5 记录电极：采用针灸针，为 单极电极 定位坐标(mm)： AP 4，LM 2， DV 3.2-3.5
1144
膜片钳技术的应用
细胞特性的研究 离子通道的鉴别 电压门控性离子通道的动力学特性研究 突触联系、突触传递的研究 疾病机制研究 药物筛选 其他
1155
突触可塑、学习记忆及其机制的研究
长时程增强（LTP）是评价学习记忆及其突触可塑的常用的电 生理指标。目前，海马脑片离体实验己经广泛用于学习记忆方面 的研究，利用膜片钳技术记录脑片LTP，可在细胞水平研究学习 记忆的机制。 当今从不同方面对突触LTP与学习记忆的关系进行了大量的研 究，其结果大致可概括为： 影响LTP的因素确实对学习研究过程产生明显的影响 影响学习过程的因素也影响LTP形成 诱导海马脑区的LTP形成可提高学习记忆活动，学习过程中伴 有海马脑区LTP的形成。
（1）一般电学性质：通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通过离子选 择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。 （2）动力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭 类型（簇状猝发样开放与闪动样短暂关闭），化学门控性通道的开、关速率常数等。 （3）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率 因子K。 （4）药理学：阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。 （5）综合分析得到最后结论。

膜片钳原理PPT课件

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5
膜片钳的放大器
膜片钳放大器是膜片钳技术的核心仪器，放大器主 要有差分放大器、频率提升部分、加法器、瞬时补偿和 钳位放大器等部件组成。放大器的核心部分是差分放大 器，此差分放大器是一电流-电压转换器，可将记录到的 电流以电位差的形式输出。到目前为止放大器的发展已 经经历了三代的发展过程。目前普遍应用的膜片钳放大 器有德国HEKA公司的EPC系列(最新的产品是EPC-9)和 美国Axon公司生产的Axon Patch 系列(最新产品是Axon200B)，日本NIHONKOHDEN公司的CEZ系列。国产放 大器有华中理共大学的PC-Ⅰ和 PC-Ⅱ系列(最新的产品 是PC-ⅡB)，上海生理所的IP-Ⅰ型等。
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11
电极内液可更换为药物或毒素等非生理 性成分，研究药物对电压依赖性通道的影响， 从而对通道开关动力学的作用达到从微观水 平上研究药物作用的功能机制。也可任意改 变膜片内外液的浓度组分，研究各组分对膜 通 透 性 的 影 响 ， 值 得 注 意 的 是 H+ 、 Ca2+ 浓 度要适宜。也可用相应的激动剂作用于膜受 体，在监测离子通道电流流动过程中，了解 经G蛋白介导的第二信使作用，研究跨膜信 息转导的途径。
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3
膜片钳技术的原理
膜片钳技术是用微管电极接触细胞膜，以千兆欧 姆（gigaohm seal GΩ）以上的阻抗使之封接，使于电 极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片patch）与其 周围在电学学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜 片上的离子通道的离子电流（pA级最小可达0.06pA） 进行检测记录的方法。
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8
膜片钳的四种工作模式
1.细胞贴附式（cell-attached） 2.全细胞模式（whole -cell recording） 3.内面向外式（inside-out） 4.外面向外式（outside-out）

膜片钳实验技术入门---基本原理与操作

膜片钳实验技术入门---基本原理与操作

膜片钳实验技术入门------基本原理与操作关兵才 李国华 刘理望按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。

因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。

【实验目的】1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。

2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。

【实验原理】一、膜片钳技术原理简介膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。

电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。

若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。

另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。

下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。

（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。

）根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。

(一)全细胞式1．电压钳制和电流记录的实现图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。

图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。

膜片钳技术原理及相关基本知识ppt课件

膜片钳技术原理及相关基本知识ppt课件

冲动，最终形成嗅觉或味觉。
• 机械门控通道
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后
者仅发现于内皮细胞和心肌细胞
• 水通道
2003年诺贝尔化学奖：
Pete Agre、 Roderick MacKinnon
失活 状态
Inactive
state
复活
recovery 静息 状态
resting state
二、门控特性(Gating)：
失活状态不仅是通道处于关闭状态， 而且只有在经过一个额外刺激使通道从 失活关闭状态进入静息关闭状态后，通 道才能再度接受外界刺激而激活开放。
失活
inactivation
开放 状态
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20
History of Ion Channel Study
• 1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage
clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现， 放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞 的运动，并提出了“通道”的概念。
• 1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模
善，真正开始了定量研究，建立了H－H模型（
膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。
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19
• 1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了
终板电位；1969年，又证实N－M接触后的Ach 以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。
• 1976年 ，德国 的Neher 和Sakmann 发明Patch
激活
activation
open state
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膜片钳PPT课件

2021
（二） 受体:细胞膜或细胞内能与某些化学物质(递质、调质、激素) 特
异性结合并产生生物效应的特殊分子。细胞膜上涉及到离子通道的主要受体：
Glu能离子型受体
激动剂
拮抗剂
AMPA
GluR1 Glu
CNQX
GluR2 AMPA
GluR3
GluR4
Kainate
GluR5 Glu
CNQX
GluR6 KA
• 配制切片液及灌流液ACSF，冻存切片液至冰水混合态 • 二元气饱和ACSF • 动物麻醉、断头、取脑、切片 • ACSF中孵育脑片至少30min • 拉制玻璃电极 • 脑片入记录槽，持续ACSF灌流1-3ml/min • 低倍镜定位，IR-DIC镜选择靶细胞
2021
23
• 玻璃微电极充灌电极内液(预配)，并固定于电极夹持器 • 维持电极正压，入液，补偿液接电位 • 操纵电极尖端至靶细胞上方，压之有凹痕（快） • 撤正压，予负压，予半量钳制电压，GΩ（1min 内）封接
1. 结构研究：生化确定蛋白质氨基酸序列+X线衍 射确定结构+……
2.功能研究：电生理技术（膜片钳） +……
3.结构和功能相结合：电生理技术（膜片钳） +转 基因技术+……
2021
3
电流钳----测电压
向细胞内注入恒定或变化的电流，记录相应膜电位变化
电压钳----测电流
为负反馈系统。注入电流，同时钳制电压于固定的某值，此时注入电流恰 好与离子通道开放产生的离子流大小相等，方向相反，以此得知该离子流大 小及方向。
后予全量钳制电压
• 补偿C-fast，破膜 • 补偿C-slow，稳定10-15min

【医学PPT课件】1991年诺贝尔生理医学奖-膜片钳技术


• 应用膜片钳技术可证明受体的存在并进行受体分 型，即通过快速换液装置加相应的激动剂、拮抗 剂及变构性调制剂，记录膜单通道的离子电流， 并根据受体的动力学及其它特性来证明所要检测 的受体。
• 膜片钳技术扩展了电生理技术的应用范围，如以 往因技术缘故难以研究哺乳动物的小细胞或脆性 很大的细胞，而今用膜片钳技术则可进行研究。
膜片钳技术原理图
Electrophysiology-Apparatus
Faraday cage
Microscope
CCD Camera
Vibration Isolation Table
Micro-Manipulators Remote Controller
Amplifiers
Electrophysiology-Apparatus
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Patch clamp
膜片钳法的各种模式
• 首先建立的单通道记录法（single channel recording）是细胞吸附式（cell-attached mode），其 后又建立了膜内面向外模式（inside-out）和膜外面 向外（outside-out）的模式。后来，又分别建立了开 放细胞吸附内面向外模式（open cell-attached insideout mode）和穿孔囊泡外面向外模式（perforated cell-attached inside-out mode）。全细胞记录法是指 在常规的方法的基础上，附加穿孔膜片（perforated patch）的模式。
1991年诺贝尔生理医学奖
膜片钳技术
主讲人：唐国奎
获奖者简介
Neher出生于1944年，德 国人

膜片钳技术讲座幻灯

膜片钳技术讲座
2002年11月20日
第一部分 膜片钳技术基本概念
第二部分
离子通道基本知识
第一部分
膜片钳技术的基本概念
主要内容
1. 膜片钳技术简介
2. 膜片钳系统中的电位（电压）与电流
3. 膜片钳系统中的电阻
4. 膜片钳系统中的电容
5. 膜片钳系统中的串联电阻和电容补偿 6. 膜片钳系统中的漏减功能 7. 膜片钳系统中的信号滤波

ρ l ρ cot(φ /2) Rp ＝Rshank＋Rtip＝ ＋ （ 1 － 1） π rs2 π rt rs
ρ为电极内液的电阻率，l为杆部长度；rs 为圆锥形的 起始半径（μm）；rt为电极尖端半径（μm）；φ为电 极尖端圆锥形的角度。

串联电阻（Series resistance, Rs）和 通路电阻（接触电阻）（Access resistance, Ra）
漏电阻（Leak risistance, RL） 又叫被动反应电阻（Passive resistance），亦即 稳态电阻（Steady-state resistance）。是指细胞膜在 某一钳制电位下离子通道恒定开启时细胞膜的阻抗。 在不同的钳位电压下， RL是不同的。计算公式为：

RL = ΔV/kΔI = ΔW/kΔD

膜片钳记录技术创立以来，记录方式的变化
经典记录模式： 贴附式（Cell-attached 或 on cell) 内膜向外式(Inside-out) 外膜向外式(Outside-out) 全细胞记录方式(Whole-cell recording) 发展记录模式： 穿孔膜记录方式（Perforated patches） 穿孔囊泡记录方式（Perforated vesicles） 高阻封接巨膜片记录方式（Gigaseal-Macropatch） 松散封接记录方式 (Loose patch clamp) 细胞内灌流记录方式(Intracellular perfusion patch) 巨大切割膜片钳记录方式（Giant excised patches）

膜片钳原理技 术PPT课件

27
kv2.1
2 nA
100 ms
Fig. Representative current of Kv2.1 channel in stable transfected HEK293 cell line. Whole–cells currents evoked during 250ms depolarizing voltage steps 10mv to rest potentials between –50 and +40mV from a holding potential of –50mV.
膜片钳原理技术
1
整体概述
概况一
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概况二
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概况三
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2Leabharlann 片钳简介345
6
膜片钳记录方式
7
8
膜片钳几种基本工作方式
9
Cell-attached recording
29
Fig. Effects of 10 µM
galantamine
on
I-V
relationship (B) and the
activation curve (C) of IK(DR) and IK(A).
In (B), each point represents
mean SEM of 7 cells for
(B) Rivastigmine caused both hyperpolarizing shifts of the steady-state inactivation of IK(A) and IK(DR) by 11 mV and 27 mV, respectively. n = 5.
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12
全细胞模式中，电极内液与细胞内液扩 散混合会改变胞内液成分而影响细胞的电变 化，还使得全细胞记录经常发生run down现 象。用穿孔膜片钳法（perforated patch）做 成全细胞模式记录即即可避免此情况，即把 制 霉 菌 素 （ nystatin ） 和 二 性 霉 素 （amphotericns）充灌到微电极中，与细胞膜 的类固醇作用后，形成只允许一价离子通过 而较大颗粒成分不能通过的小孔，这些小孔 为导电性孔道，不会影响所记录的电流。相 比之下制霉菌素效果较好。
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1
前言
一般认为，电生理学研究起于1791年，基本上随 电学仪器的进步而发展的，主要经历了微电极技术、 电压钳技术和膜片钳技术。微电极技术由来以久，在 此基础之上发展起来 的电压钳技术为阐明细胞兴奋 性的生理机制作出了巨大贡献。在电压钳的基础上， 1976年德国马普所的E.Neher和B.Sakman在电压钳的基 础上建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique)，并首次报道了用膜片钳技术记录到的细胞 膜离子通道电流， 但是实验记录的背景噪声仍然很大。
膜片钳技术包括细胞的分离和膜处理技术，膜片钳放 大器等试验仪器的安装和调试，微电极的制作，数据 的采集和处理技术等。
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4
膜片钳实验的构成
膜片钳实验仪器设备主要有放大器、微 型操纵器（微超）、倒置显微镜、防震台、 屏蔽笼、灌流槽和数据采集和处理设（计算 机 ） 。 其 中 膜 片 钳 放 大 器 （ amplifier ） 、 微 型操纵器（微操micromanipulator）、倒置显 微镜(inverted microscope)是膜片钳实验区别 于一般电生理实验所需要的仪器。
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7
合格的微电极是成功封接细胞膜的基本条件
膜片钳实验要成功的封接，一是设法造成 干净的细胞表面，二是制成合格的电极。电极 采用两步拉制工艺。电极的充灌是利用毛细管 由尖端通过虹吸作用吸入溶液，再用注射器连 接的微细塑料管，由电极粗端插入电极尖端作 反向充灌，避免有气泡留在电极尖端。每一种 标本的制备方法各不相同，在此不详细介绍。
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8
膜片钳的四种工作模式
1.细胞贴附式（cell-attached） 2.全细胞模式（whole -cell recording） 3.内面向外式（inside-out） 4.外面向外式（outside-out）
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以全细胞模式为例对膜片钳作一简要介绍
在倒置显微镜下，使微电极逐渐靠近细胞，在微 电极接触细胞的同时给与微电极一个小的负压，形成 当吉欧封接，再向微电极管内加入一个小的负压，使 电极覆盖下的细胞膜破裂（rupture），形成电极内液 和胞内液相通，但与浴池内的溶液绝缘，形成全细胞 模式。全细胞模式是记录全细胞面积的而不是小片膜 的离子电流，虽然电极内的膜片被吸破，但微电极与 细胞的封接阻抗很高（100兆欧），这是保持全细胞 记录的重要条件。
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膜片钳的放大器
膜片钳放大器是膜片钳技术的核心仪器，放大器主 要有差分放大器、频率提升部分、加法器、瞬时补偿和 钳位放大器等部件组成。放大器的核心部分是差分放大 器，此差分放大器是一电流-电压转换器，可将记录到的 电流以电位差的形式输出。到目前为止放大器的发展已 经经历了三代的发展过程。目前普遍应用的膜片钳放大 器有德国HEKA公司的EPC系列(最新的产品是EPC-9)和 美国Axon公司生产的Axon Patch 系列(最新产品是Axon200B)，日本NIHONKOHDEN公司的CEZ系列。国产放 大器有华中理共大学的PC-Ⅰ和 PC-Ⅱ系列(最新的产品 是PC-ⅡB)，上海生理所的IP-Ⅰ型等。
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电极内液可更换为药物或毒素等非生理 性成分，研究药物对电压依赖性通道的影响， 从而对通道开关动力学的作用达到从微观水 平上研究药物作用的功能机制。也可任意改 变膜片内外液的浓度组分，研究各组分对膜 通 透 性 的 影 响 ， 值 得 注 意 的 是 H+ 、 Ca2+ 浓 度要适宜。也可用相应的激动剂作用于膜受 体，在监测离子通道电流流动过程中，了解 经G蛋白介导的第二信使作用，研究跨膜信 息转导的途径。
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膜片钳实验中几个常用术语
吉欧封接（gigant seal） 指玻璃微电极与细胞 表面接触紧密，在电学上与细胞膜的其它部分相 分离。
破膜（rupture） 是指达到吉欧封接后，再 施加一个小的负压，使细胞膜破裂，从而形成全 细胞模式。
run-down 在全细胞模式中破膜后，细胞 浆在负压的作用下进入微电极中，细胞很快就萎 缩。正常情况下，全细胞模式可以维持１个小时 左右。
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6
因为膜片钳实验所用的标本多为急性分离 的细胞或是培养的细胞，故需要倒置显微镜放 置标本。目前性能最好的倒置显微镜是德国产 的Zeiss显微镜。
在膜片钳实验中，微操起着十分重要的作 用，微操的性能的优劣主要体现在稳定性上。 现在使用的微操主要有机械操纵性、三维液压 操纵性、压电操纵性３种，其中以压电微超的 稳定性最佳。其它相关设备在此不一一介术是用微管电极接触细胞膜，以千兆欧 姆（gigaohm seal GΩ）以上的阻抗使之封接，使于电 极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片patch）与其 周围在电学学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜 片上的离子通道的离子电流（pA级最小可达0.06pA） 进行检测记录的方法。
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1980年Neher于在一次实验中偶然的向微电极 内施加一点负压（20-30cmH2O）,封接电阻骤然增 大了两个数量级，达到10-100GΩ，且背景噪声显 著减低，后来将这种电阻大于gigaΩ(109 Ω)的封接 称为giga-seal。1981年，Hamill等在实现giga-seal 的基础上建立了膜片钳记录的4种基本模式，在此 基础上，以后有发展了许多新的记录模式，从而大 大扩展了它的应用领域。Neher 和Sakman 也因此获 得1991年度的诺贝尔医学和生理学奖。当今全世界 每年有1000篇以上采用膜片钳技术的研究论文发表。