旋毛虫新生幼虫WN1抗原基因的克隆及表达

旋毛虫新生幼虫WN 1抗原基因的克隆及表达高长玲1,付宝权1,2,刘明远1*,郭　桓1,孙树民1,吴秀萍1,卢　强1,陈启军3,P .Boireau 2　(1.吉林大学　畜牧兽医学院,吉林长春130062;2.法国食品卫生安全局,巴黎94703;3.瑞典微生物与肿瘤研究中心,　斯德哥尔摩S-17177)摘要:应用旋毛虫人工感染猪血清对旋毛虫新生幼虫cDN A 文库进行免疫筛选,对阳性克隆W N 1序列进行生物信息学分析。

结果表明,W N 1cD NA 全长为474bp ,含有1个354bp 的完整的开放阅读框架(O RF ),编码的多肽由117个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为13200,等电点为4.25,N -末端的信号肽表明其可能为分泌性蛋白。

GenBank 数据库检索结果显示,此序列为一个新基因的全长cDN A 。

经PCR 扩增WN 1基因,将其克隆到原核表达载体pET 28a,重组质粒经鉴定后,转化大肠杆菌BL 21star (DE3)并诱导表达出相对分子质量为15000的重组蛋白,与理论设计完全相符。

关键词:旋毛虫;新生幼虫;基因克隆;表达中图分类号:S 852.7;Q 78 文献标识码:A 文章编号:1005-4545(2005)03-0276-02 收稿日期:2004-10-10 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170709,30328020);中法先进研究计划项目(PRA BT O3-02) 作者简介:高长玲(1969-),女,硕士。

*通讯作者 旋毛形线虫(T richinella sp ir alis ,简称旋毛虫)病是一种人兽共患寄生虫病。

由于其病原传播极其复杂,该病尚未得到完全有效的控制,成为一种全球性的疾病,在我国该病仍有暴发流行,严重地危害着人类健康,给畜牧业及食品工业带来了重大的经济损失[1]。

预防和控制旋毛虫病的关键在于建立起一套快速、简便、特异性高的检测方法,并采取各种预防措施降低动物的感染率。

旋毛虫新生幼虫期是宿主最易接受刺激和产生免疫反应的敏感时期[2]。

新生幼虫代谢旺盛,在短时间内合成大量蛋白,其分泌的侵袭因子很可能是高特异性和强保护性抗原。

因此,通过对新生幼虫的研究,对于探明旋毛虫侵袭机理及旋毛虫病的防制具有重要的意义。

我室已经构建了中国河南猪旋毛虫分离株(T .sp iralis ISS534)新生幼虫cDN A 文库[3],对其进行了免疫筛选[4]。

本试验对阳性克隆W N 1进行了序列分析,并将W N 1基因克隆于原核表达载体后,在大肠杆菌中进行了高效表达,为今后进一步研究旋毛虫病奠定了理论基础。

1　材料与方法1.1　主要试剂　T 4DN A 连接酶、IPT G ,购于P ro mega 公司;EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ、T aq DN A 聚合酶等常用试剂,均购自T aK aRa 公司。

Pr imer 1、T 3pr imer 、T 7primer ,均由T aKaR a 公司合成。

原核表达载体pET -28a 、菌株E .coli N ova Blue 、E .coli BL 21star (DE3)等,购自N ov ag en 公司。

切胶回收试剂盒,购于Q iag en 公司,P CR 清洁试剂盒,购于杭州维特洁生化试剂公司。

蛋白M a rker 购于鼎国试剂公司。

1.2　基因克隆及序列分析　旋毛虫新生幼虫cDN A 文库的免疫筛选参照文献[4]进行。

对阳性克隆pBK -CM V -W N 1以T 3及T 7为通用引物做PCR 鉴定,送上海鼎安生物技术有限公司测序。

应用DN A T ools ,M otif Scan ,Signal P2.0和Bla st 软件,对W N1cDN A 序列及其编码蛋白质的结构域,信号肽进行分析,并登陆G enBank 数据库进行同源性检索。

1.3　重组质粒的构建1.3.1　引物设计　由于旋毛虫新生幼虫WN 1全长cD NA 上游5′端带有信号肽,不利于原核表达,因此利用PCR 技术将信号肽去除。

P CR 所用引物分别为:上游引物P 1序列为5′-CC GA A T T CG CA G A T T CG A G T G CA -3′,5′端带有1个Eco R Ⅰ酶切位点A A T T CG ;下游引物为旋毛虫新生幼虫cD-N A 文库载体pBK -CM V 质粒上的T 7通用引物,其序列为5′-G T A A T A CGA CT CA CT A T A G GG C -3′,引物T 7前99个碱基处带有1个Xho Ⅰ酶切位点CT CG AG ,因此去除信号肽的扩增产物可用EcoR Ⅰ与X ho Ⅰ进行双酶切,以用于与pET -28a 载体的重组。

1.3.2　目的基因PCR 扩增　以pBK-CM V -WN 1质粒作模板扩增W N 1基因。

P CR 反应条件:94℃变性5min;94℃1min,55℃1min,72℃1min,共35个循环;72℃10min 。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物后,切胶回收试剂盒回收PCR 产物,并用EcoR Ⅰ与X ho Ⅰ双酶切,37℃5h,酶切产物用PCR 清洁试剂盒回收。

1.3.3　目的基因的克隆　取目的基因片段的酶切产物,经Eco R Ⅰ和X ho Ⅰ双酶切的pET -28a 质粒载体,用T 4DN A 连接酶16℃连接过夜。

将连接产物转化感受态菌N ov eblue,37℃培养后,将转化的重组子挑单菌落用PCR 方法快速鉴定,并测序。

1.4　重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达　将测序鉴定正确的表达重组质粒pET 28a -WN 1转化表达宿主菌BL 21st ar(DE 3)。

将转化的重组子挑单菌落分别接种于含卡那霉素的LB 液体培养基中,当其D 600值达0.6时,加入IP T G 使其终浓度为1mm ol /L ,37℃诱导培养,诱导时间分别为:0、1、2、3、4、5、6h 。

并设空载体pET 28a 转化BL 21star (DE3)的诱导与未诱导对照。

1.5　SDS -PAGE 检测重组蛋白　灌制12%SDS -聚丙烯酰胺凝胶。

分别收集相同的菌体(1mL )离心弃上清,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸离心后点样电泳。

电泳后凝胶用考马斯亮蓝染色过夜,脱色液脱色至背景完全透明。

与对照菌及蛋白M arker 对比以检测表达蛋白。

2　结果2.1　阳性克隆WN1的cDNA 序列分析　测序结果显示,WN 1cDN A 全长由474bp 组成,含有1个354bp 的完整的开放阅读框架(O RF ),G C 含量为35.02%,第12～14位核苷酸为启始密码子A T G,第363～365位核苷酸为终止密码子T A A ,第437～442位核苷酸为加po ly (A )信号A A T A A A 。

WN 1核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列见图1。

图1　W N1核苷酸序列及其编码蛋白质氨基酸序列　核苷酸下划线为引物位置和加p olyA 信号;氨基酸加下划线部分信号肽,方框代表糖胺聚糖结合位点2.2　编码蛋白质氨基酸序列分析　该O RF 编码的多肽由117个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为13200,等电点为4.25,亲水性氨基酸占35.0%,疏水性氨基酸占36.8%,碱性氨基酸占10.3%,酸性氨基酸占17.9%。

Sig na l P 2.0分析表明第1～20位氨基酸区域为信号肽序列。

M o tif Scan 分析显示:氨基酸序列第39～42位为糖胺聚糖附加位点;第58～63、108～113位为十四烷基化位点;第39～41位为蛋白激酶C 磷酸化位点;第23～26,89～92位为酪蛋白激酶磷酸化位点。

2.3　GenBank 数据库同源性分析　BlastN 核酸数据库检索表明与旋毛虫T sO RF 11.30(T SU 88238)同源性为87%。

旋毛虫EST 数据库检索表明共有38条EST 序列与之相似,同源性为80%～100%,其中来源于肌幼虫期的EST 序列共8条,与T s O RF 11.30(T SU 88238)相似,同源性为87%左右;来源于成虫的EST 序列共30条,可分为2组;第1组与G en-Bank 数据库T sO RF 11.30(T SU 88238)相似,同源性为87%左右,第2组与基因W N 1同源性为99%左右。

BlastP 蛋白数据库检索表明WN 1编码蛋白与旋毛虫T sOR F 11.30(A A B48488)的氨基酸同源性为81%。

2.4　WN1目的基因片段的克隆　以pBK-CM V -WN 1为模板,用上游引物、下游引物扩增出不含信号肽序列的WN 1cDN A 片段。

与pET 28a 载体连接转化N oveblue 宿主菌后,重组质粒经P CR 和酶切鉴定及测序表明,读码框架正确,插入片段与原始序列相同,克隆后W N 1基因未发生突变,可以用于表达。

2.5　重组质粒pET 28a -WN 1表达产物的SDS -PAGE 检测　将pET 28a-W N 1重组质粒转化BL 21star (DE3)感受态细胞,经I PT G 分别诱导0、1、2、3、4、5、6h ,其菌体裂解物经SDS -PA GE ,可检测到1条约15000的特异性蛋白带,与理论相对分子质量相符。

而未诱导(0h)及非重组pET -28a 对照菌均无特异性蛋白带(图2)。

图2　重组质粒pE T28-W N1表达产物的SDS-PAGE 检测　1.未诱导的空载体pET 28a 转化子;2.诱导的空载体pET 28a 转化子;3.标准分子量蛋白;4.未诱导的重组质粒pET 28a -W N 1转化子;5～10.分别诱导1～6h 重组质粒p ET28a-WN 1转化子3　讨论 本试验对旋毛虫新生幼虫cD NA 文库免疫筛选阳性克隆WN 1进行了分析,结果表明,WN 1cDN A 是一个尚未见报道的旋毛虫新基因,全长474bp,含有1个354bp 的开放阅读框架,编码的117个氨基酸。

Sig nal P 2.0分析显示,第1～20位氨基酸区域为信号肽,含有信号肽的蛋白质一般能够被分泌到细胞外,可能有重要的生物学功能。

同源性分析表明,WN 1基因在旋毛虫可能形成一个基因家族,至少有2个基因成员,WN 1和T sO RF 11.30,它们在不同旋毛虫种,不同分离株之间可能存在基因多态性,在旋毛虫不同发育时期的表达也具有特异性,其功能可能有差异,需要进一步研究。

由于信号肽序列可能影响真核生物基因在原核表达系统中的表达,在原核系统表达此基因时,为提高基因的表达效率,采用PCR 技术对W N 1全长cDN A 进行了改造即去除其N 端的信号肽,其余部分编码98个氨基酸,加上表达载体36个氨基酸,融合蛋白共134个氨基酸,理论相对分子质量为15000。