芽孢杆菌分离纯化及保种

/dxyz-b109-99-t-345518非常详细各菌种保存方法的优缺点1．斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。

酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。

缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。

2．液体石蜡保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。

（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。

此法实用而效果好。

霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。

此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。

缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。

从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

3．滤纸保藏法（1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟。

（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

中国水产科学 2018年5月, 25(3): 567-575 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-10-17; 修订日期: 2017-12-06.基金项目: 山东省农业良种工程重大课题; 山东省自主创新与成果转化专项(2014ZZCX06205); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(20603022016008).作者简介: 王金燕(1991–), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为微生态学. E-mail: hileon12@ 通信作者: 王印庚, 研究员. E-mail: wangyg@ DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17383刺参养殖池塘一株贝莱斯芽孢杆菌的分离及其生理特性王金燕1, 2, 李彬2, 王印庚2, 廖梅杰2, 荣小军2, 张正2, 牛盈盈3, 宁鲁光31. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306;2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所, 青岛海洋科学与技术国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071;3. 山东海跃水产科技有限公司, 山东 东营 257500摘要: 2014年5月, 在东营的刺参(Apostichopus japonicus )养殖池塘环境中对水样和底泥样品进行了细菌分离和益生菌的筛选, 共获得66株可培养细菌。

以刺参“腐皮综合征”主要致病菌为指示菌进行拮抗作用实验, 使用选择培养基对菌株的产淀粉酶和蛋白酶能力进行测定, 筛选获得一株潜在益生菌株——DY-6, 并进行了生理生化实验、16S rDNA 基因序列分析、菌株生长特性及其对刺参的安全性研究。

结果表明, DY-6对其指示菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens )、灿烂弧菌(Vibrio splendidus )、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus )和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus )均有良好的抑制作用, 抑菌圈直径分别达到24 mm 、22 mm 、27 mm 和37 mm, 对淀粉和蛋白培养基的水解直径分别为28 mm 和20 mm 。

菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。

菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。

（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。

其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。

在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。

如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。

与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。

（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。

平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。

2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。

甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。

微生物学实验
——土壤中微生物的分离纯 化、培养观察及保藏
实验流程
土 壤 分样 离品 纯中 化微 生 物 的
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
形态结构观察
生理生化反应
nisin效价测定
生长曲线测定
菌
种
形态观察
保
直接计数
藏
死活细胞鉴定
形态结构观察
土壤中微生物的分离、纯化 和培养
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后 者在强碱环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二 乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+） 反应。
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 1
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 2
细菌细胞的生理生化反应
其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件如营养成分酸碱度温度和氧等或加入某种抑制剂在平板上培养微生物当平板上长出单菌落后挑取得到纯种的微生物土壤中微生物的分离纯化培养观察及保藏试剂与器材1材料含大肠杆菌枯草芽孢杆菌乳酸乳球菌黑曲霉根霉青霉和放线菌的土壤样品牛肉膏蛋白胨培养基斜面液体半固体马丁氏培养基查氏培养基等2试剂10酚4水琼脂3器材盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶涂布器无菌吸管接种环酒精灯无菌培养皿显微镜细胞计数板等
细菌的革兰氏染色
试剂与器材
1、材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2、试剂
结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。
3、器材
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。
Procedures of Gram Staining