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人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
人间充质干细胞培养试剂盒说明书【产品名称】通用名称：人间充质干细胞培养试剂盒【产品型号】A型、B型【包装规格】500mL/kit【预期用途】仅用于对人间充质干细胞的增殖培养，不具备对细胞的选择、诱导、分化功能。
培养后的细胞用于体外诊断。
【检验原理】细胞培养广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一，建立合适的细胞培养方案能够有效提高实验效率和实验稳定性，同时节约实验成本。
在传统细胞培养过程中，培养基中大多含有FBS或FCS，由于血清中含有的很多未知成分会抑制或者刺激细胞，从而干扰实验，并且由于血清的不确定性，不同批次对于实验的影响也不同，造成了实验的重复性降低，因此我们推出不含血清的人间充质干细胞培养试剂盒，该试剂盒可有效避免因血清质量和血清组分变动对实验造成影响，提高细胞培养和实验结果的可重复性。
【主要组成成分】产品名称型号规格组成成份数量体积人间充质干细胞培养试剂盒A型（有酚红）500mL/Kit人间充质干细胞基础培养基(A型)1瓶475mL人间充质干细胞培养添加物1瓶25mL B型（无酚红）500mL/Kit人间充质干细胞基础培养基(B型)1瓶475mL人间充质干细胞培养添加物1瓶25mL【储存条件及有效期】人间充质干细胞基础培养基未开封并且2℃~8℃保存，有效期为1年；人间充质干细胞培养添加物未开封并且-80℃~-20℃保存，有效期为1年；两者混合后置于2℃~8℃保存，有效期2周。
【样本要求】1、细胞要求：原代培养或冻存复苏的人间充质干细胞；2、细胞悬液要求吹打混匀，成单细胞悬液。
【检验方法】准备工作1、准备25mL的人间充质干细胞培养添加物，37℃水浴解冻，若有沉淀析出，可用0.22μm细胞滤器过滤或4℃，3000g/10min离心取上清，该步骤不影响实验结果；2、准备475mL的人间充质干细胞基础培养基，恢复到室温；3、将人间充质干细胞培养添加物加入475mL人间充质干细胞基础培养基中，即可得到5%浓度的完全培养基；4、配置好的人间充质干细胞完全培养基可于2-8℃保存2周。
2024 年 3月第 61 卷第 2 期Mar. 2024Vol. 61 No. 2四川大学学报（自然科学版）Journal of Sichuan University （Natural Science Edition）成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化杨雅丽1，2，司琪琦1，王思瑜1，周嘉裕1，郭泰林2（1.西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031； 2.西南交通大学医学院，成都 610031）摘要: 为探究成骨细胞（OBs）线粒体移植对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨分化的影响，本研究体外人工提取BMSCs线粒体和OBs线粒体，分别移植入受体BMSCs.实验结果发现，接受成骨细胞线粒体的BMSCs表现出显著增强的增殖、迁移、抗凋亡和成骨能力.此外，接受成骨细胞线粒体的BMSCs胞内活性氧水平降低、氧气消耗速率上调、ATP产量增加.以上结果表明，（1）成骨细胞线粒体移植能够增强体外BMSCs功能，促进其向成骨分化；（2）相较于接受骨髓间充质干细胞线粒体，接受成骨细胞线粒体移植的受体BMSCs具有更强的有氧代谢能力以及更强的成骨分化能力，有望为骨生长与骨损伤修复提供一种候选方法.关键词: 线粒体移植；骨髓间充质干细胞；成骨细胞；成骨分化；代谢中图分类号: Q599 文献标志码:A DOI:10.19907/j.0490-6756.2024.026001Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes proliferation，migration and osteogenic differentiation of bone marrowmesenchymal stem cell in vitroYANG Ya-Li1，2， SI Qi-Qi1， WANG Si-Yu1， ZHOU Jia-Yu1， GUO Tai-Lin2（1.School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 6100031， China；2.School of Medicine， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China）Abstract: To explore the effect of mitochondrial transplantation of osteoblasts （OBs） on osteogenic differen‑tiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）， this study artificially extracted BMSCs mitochon‑dria and OBs mitochondria in vitro and transplanted them into recipient BMSCs respectively.The experimen‑tal results showed that BMSCs receiving osteoblast mitochondria showed significantly enhanced proliferation，migration， anti-apoptosis and osteogenesis.In addition， the level of intracellular ROS in BMSCs receiving os‑teoblast mitochondria decreased， the rate of oxygen consumption increased， and ATP production increased. These results indicated that：（1） Mitochondrial transfer can enhance the function of BMSC in vitro and pro‑mote its osteogenic differentiation；（2） Compared with bone marrow mesenchymal stem cell mitochondria，recipient BMSCs receiving osteoblast mitochondrial transplantation may have stronger aerobic metabolic ca‑pacity and osteogenic differentiation ability， which is expected to provide a candidate method for bone growth and bone injury repair.Keywords: Mitochondria transplantation；Bone marrow mesenchymal stem cells；Osteoblasts；Osteogenic differentiation； Metabolism收稿日期: 2023-02-13基金项目: 四川省科技厅应用基础研究项目（Q114321S01003）作者简介: 杨雅丽（1998-），女，陕西商县人，硕士研究生，研究方向为代谢与骨组织工程.E-mail： yangyali0331@通讯作者: 周嘉裕.E-mail： spinezhou@第 2 期杨雅丽，等：成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷1 引言骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床上常见的病症［1，2］.间充质干细胞（MSCs）是一种多能、自体更新的成体干细胞，可分化为多种组织［3］.骨髓间充质干细胞（BMSCs）易于从骨髓中分离，并可以在体外扩增到足够数量用于临床应用［4］，因此被认为是骨组织工程中很好的治疗工具.然而，在体外长期分离培养后，BMSCs的功能特性可能会受损［5］，因此修饰BMSCs以增强其功能已成为干细胞介导的骨组织再生研究的主要焦点.成骨细胞谱系细胞包括骨髓间充质干细胞、前成骨细胞、成骨细胞（OBs）（通常称为成熟成骨细胞）、骨内衬细胞和骨细胞.骨健康取决于成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡［6］.成骨细胞源于骨髓间充质干细胞，成熟的成骨细胞分化后形成骨基质并开始矿化形成骨组织.成骨细胞是骨重塑的基础，对骨骼的生长和维持至关重要.能量代谢是从营养物质中产生能量（即ATP）的过程［7］.这一过程对于维持细胞稳态和对不同条件作出反应是必不可少的.细胞需要能量来生长和维持，并且已经进化成具有多种产生能量的途径［8，9］.遗传和功能研究都表明，能量代谢，如葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代谢，在骨细胞（包括成骨细胞、骨细胞和破骨细胞）的形成和功能中起着重要作用［10］.此前有文献证明移植骨髓间充质干细胞线粒体增强了干细胞的增殖、迁移以及成骨分化能力［11］ .在骨骼发育和重塑的过程中成骨细胞发挥重要功能［12］，有研究证实成骨细胞比骨髓间充质干细胞更依赖糖酵解产生能量，其中的线粒体DNA的拷贝数、呼吸酶的蛋白亚基、耗氧率和ATP含量均有所增加［13］.然而，有关成骨细胞线粒体移植对于干细胞分化影响有关的研究尚未见报导.为了探究不同来源线粒体移植对干细胞增殖和分化的影响，实验同时设置了3个组别，采用体外人工提取骨髓间充质干细胞线粒体和成骨细胞线粒体的方法，分别移植入受体骨髓间充质干细胞，通过CCK-8，RT-qPCR，Western Blot等手段评估不同来源线粒体移植对BMSCs增殖、迁移以及促成骨能力的影响，以期为进一步探究改善提供参考.2 材料与方法2.1 材料1-2 w Sprague Dawley大鼠（成都达硕实验动物有限公司，中国）.2.2 方法2.2.1 细胞提取、培养及传代采取断颈法处死大鼠，提取骨髓间充质干细胞：剪下大鼠的后腿股骨，用针管将细胞从骨髓腔中吹出，在配置好的α-MEM培养基（90% α-MEM培养基+10% FBS+1%双抗）中培养；提取OBs：剪下大鼠的头盖骨，用刮刀轻轻的将头盖骨刮至透明状态，放入α-MEM培养基（同上）培养.细胞在培养箱（37 ℃，5%，CO2）中培养，2~3 d换一次培养基.细胞生长至80%~90%，进行传代培养：去除培养基，加入胰蛋白酶（0.25%，含1 mmol/L EDTA）消化下来后离心（1200 r/min，5 min），除去上清液至培养瓶中继续培养［14］.所有实验均使用3~5代的细胞. 2.2.2 线粒体提取和移植使用线粒体提取试剂盒Mammalian Mitochondria Isolation Kit for Tis‑sue and Cultured Cells（Biovison，美国）提取线粒体.将受体细胞和供体细胞都接种在6孔板中（10万/孔），供体细胞长至融合度80%~90%时消化供体细胞.加入1 mL线粒体分离缓冲液并用注射器吹打5 s，加入10 µL试剂A，冰上孵育5 min.4 ℃下以600 g离心10 min，收集到的上清液在4 ℃下以7000 g离心10 min，将得到的线粒体使用培养基重悬后加入受体细胞，缓慢均匀摇晃促进线粒体进入［11］.2.2.3 线粒体、细胞骨架荧光染色用不含血清、酚红的DMEM培养基（Sigma，美国）稀释线粒体绿色荧光探针MitoGreen（江苏凯基生物，中国）原液至500 nmol/L.供体细胞接种在6孔板中（10万/孔），每组设置三个平行样，待供体细胞长至融合度80%~90%时消化供体细胞.用预热的染色液悬浮细胞，37 ℃孵育30 min.完成染色后，避光提取线粒体，转移至受体细胞中共同培养24 h.消化受体细胞后用无血清、无双抗的DEME培养基重悬（1×106细胞/mL），每孔加入100 µL ，20 µg/mL鬼笔环肽-罗丹明（Sigma，美国）进行细胞骨架染色.避光室温孵育30 min，离心弃上清，用PBS悬浮细胞，重复两次以上洗涤步骤后每个样随机选取5个视野使用荧光显微镜（FV1000，第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期Olympus，日本）进行观察并拍照.2.2.4 流式细胞术为了进行定量验证，在分离前使用浓度为500 nmol/L的MitoGreen FM（吸收/发射=530 nm/590 nm）标记供体OBs中的线粒体（方法同上2.2.3）.使用BD Accuri C6 Plus流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）对受体BMSCs 进行定量，每组设置三个平行样，每个样本至少有10 000个细胞，使用FlowJo软件分析FITC发射区的平均荧光强度（MFI）.2.2.5 CCK-8 按实验组别在96孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（1万/孔），每组设置三个复孔.培养24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液（DOjinDO，中国上海），孵育2 h后用酶标仪（SPECTROstar Nano，BMG LABTECH，德国）测定450 nm处的吸光度.对照组和实验组分别以空白组为参照，用公式计算细胞存活率=［（As-Ab）］×100%（As：对照孔/实验孔吸光度；Ab：空白孔吸光度），得到的数据使用GraphPad Prism 8软件分析制作直方图.2.2.6 细胞划痕按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞进行培养，每组设置三个复孔，待细胞生长至80%~90%左右时，在每孔的中间用1 mL移液枪枪头轻轻划一道粗细相同的空隙.将孔板放至光学显微镜下拍照（10×）后继续放入培养箱培养，48 h后再次拍照（10×），对比每组别细胞迁移情况.2.2.7 细胞凋亡按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞进行培养，每组设置三个复孔，待细胞生长至80%~90%时收集细胞上清.向孔板中加入胰蛋白酶（0.25%）消化细胞，2~5 min后用收集的上清终止消化收集细胞；用PBS清洗细胞两次后用DAPI染色液（Biosharp，中国安徽）和细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-EGFP/PI Cell Apoptosis Detection kit （Service‑bio，中国武汉）处理，随后在每个样随机选取5个视野在荧光显微镜下用三色滤光片进行观察，DAPI呈蓝色荧光信号，Annexin V-EGFP呈绿色荧光信号，PI呈红色荧光信号.2.2.8 RT-qPCR 按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞，每组三个平行样，分别培养4，7，14 d.培养结束后加入Trizol试剂（Life Technologies，美国）提取RNA.使用逆转录试剂盒（Thermo Fisher，美国）按照一定的体系逆转录（25 ℃，5 min→42 ℃，60 min→70 ℃，5 min→4 ℃，∞）为cDNA.通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）查找所需目的基因序列，使用 Primer-BLAST 设计目的基因的引物序列，引物由擎科生物科技有限公司（成都）进行合成.引物序列见表1.以逆转录得到的 cDNA为模板链，在ABI QuantStudio3实时聚合酶链式反应系统（CFX96，Bio-rad，美国）上进行定量实时聚合酶链式反应｛95 ℃，5 min→（95 ℃，15 s →60 ℃，1 min）循环39次→70 ℃到95 ℃梯度升温（0.02 ℃/s）｝［15］.2.2.9 Western Blot 按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞，每组三个平行样，分别培养4，7，14 d.培养结束后每孔加入 120~ 150 μL RIPA裂解液（Boster，美国），1%广谱蛋白酶抑制剂（Boster，美国）和1% PMSF（Boster，美国）裂解蛋白.加5× loading buffer（Boster，美国）95 ℃水浴10 min.总蛋白提取液（30 μg）经10%（w/v）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离后，转移到PVDF膜上.用5%（w/v）的脱脂牛奶封闭膜，在4 ℃下与Runx2鼠源一抗（1∶100，sc-390351，SANTA CRUZ，美国），β-actin鼠源一抗（1∶5000，bam-33036M，Bioss，中国北京）孵育过夜，然后羊抗鼠二抗（1∶5000，BA1054，Boster，美国）孵育2 h.使用Clarityt TM Western ECL Sub‑strate（BIO-RAD，美国）进行显色，适当时间后用凝胶成像系统（ChemiDoc MP，Bio-rad，美国）进行表1 实时定量聚合酶链式反应引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences基因名（Gene name）GAPDHOsteopontin （OPN）Osteocalcin（OCN）RUNX family transcription factor 2 （Runx 2）Alkaline phosphastase （ALP）上游引物序列（5′→3′）CCCTTAAGAGGGATGCTGCC CTTGCTTGGGTTTGCAGTCTT CCGTTTAGGGCATGTGTTGC AATTAACGCCAGTCGGAGCA GGGCCTGCTCTGTTTCTTCA下游引物序列（5′→3′）TACGGCCAAATCCGTTCACAGCCACTGCAGGCTTACCTTGTTTCGAGGCAGAGAGAGGGACACTTCTCGGTCTGACGACGCTGAGATTCGTCCCTCGCTG第 2 期杨雅丽，等：成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷放射自显影.蛋白质表达水平归一化为β-actin. 2.2.10 茜素红染色按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设置三个复孔.将培养板放在培养箱预培养（37 ℃，5%，CO2的条件下）培养.贴壁后更换成骨诱导培养基（100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸）［16，17］，培养14 d后每组随机选取5个视野在光学显微镜下拍照观察细胞密度，随后用PBS清洗，加入95%乙醇固定15 min，每孔加入1 mL，1%的茜素红（源叶生物，中国上海），室温放置30 min，对细胞进行染色后用体式显微镜（SG-700，萨伽，中国苏州）观察.2.2.11 碱性磷酸酶染色按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设置三个复孔.贴壁后更换成骨诱导培养基（100 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸）培养14 d后每组随机选取5个视野在光学显微镜下拍照观察细胞密度，随后移除培养基，加入95%乙醇，固定15 min.用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天，中国上海）进行染色，每孔加入1 mL BCIP/NBT染色工作液，室温避光孵育30 min，去除BCIP/NBT染色工作液，用体式显微镜（SG-700，萨伽，中国苏州）观察.2.2.12 ROS 按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设置3个复孔.待细胞生长至80%~90%时，用无血清α-MEM培养基（1%双抗）稀释活性氧检测试剂盒（YEASEN，中国上海）中的DCHA-DA，使其终浓度为10 mmol/L.每孔加入1 mL稀释好的DCFH-DA工作液，37 ℃培养箱避光孵育30 min；用无双抗α-MEM培养基（10%胎牛血清）洗涤细胞1~2次后每个样随机选取5个视野使用荧光显微镜（488 nm激发波长，525 nm发射波长）观察并拍照.2.2.13 细胞线粒体压力测定实验前一天预热海马生物能量测定仪（Agilent Seahorse XFp，Sea‑horse，美国）；在前一天专用Seahorse XFp 细胞培养板（Agilent Seahorse XFp，103025-100，美国）中按组别加入BMSCs（1万/孔），每组三个平行样.实验当天，从Seahorse XF DMEM Medium （103575-100）中分装出9.7 mL，向其中分别加入100 μL glucose、100 μL pyruvate、100 μL glutamine混匀配置成检测液.培养好的贴壁细胞中的培养基置换为配置好的检测液，置放入37 ℃，无CO2细胞培养箱培养60 min后加入药物（A孔加入20 μL，15 μmol/L oligomycin，B孔加入22 μL，15 μmol/L FCCP，C孔加入25 μL，2.5 μmol/L FCCP ，D孔加入207 μL，5 μmol/L FCCP）.上机运行XFp Cell Mito Stress Test实验.2.2.14 统计分析本研究通过t检验（Graph‑pad，Version 8.0，SanDiego，CA，USA）比较两组的数据，通过Tukey多重比较检验及方差分析（ANOVA）对多组间数据进行分析.P＜0.05表示差异具有统计学意义.3 结果3.1 成骨细胞线粒体在体外成功移植入骨髓间充质干细胞为了验证从成骨细胞中提取的线粒体能否有效地移植到骨髓间充质干细胞中，在提取线粒体前用MitoGreen标记供体成骨细胞中的线粒体（图1a）供体细胞/受体细胞比例为1∶1）.线粒体移植24 h后，染受体细胞的细胞骨架（图1b），然后在荧光显微镜下进行观察，在受体细胞出观察到了供体线粒体的荧光（图1c）.这表明来自成骨细胞中的线粒体能够成功移植进入受体细胞.用流式细胞术检测线粒体成功移植的效率，线粒体在分离前也用MitoGreen标记，受体细胞或对照细胞的平均荧光强度通过FACS定量.对照组中阳性细胞的百分比设定为0.15%，接受成骨细胞线粒体移植的受体细胞阳性率为34.1% （图1d），表示受体细胞中34.1%成功移植了线粒体.3.2 成骨细胞线粒体移植增强骨髓间充质干细胞的体外增殖、迁移、抗凋亡能力骨髓间充质干细胞需要很强的增殖能力才可以有足够的数量治疗骨缺损，本实验研究了成骨细胞线粒体移植对体外培养的骨髓间充质干细胞增殖能力的影响.在移植线粒体24 h后进行CCK8检测，移植了线粒体的细胞的增殖能力比未移植线粒体的细胞强，其中，接受成骨细胞线粒体的细胞（实验组）的增殖能力比接受骨髓间充质干细胞线粒体的细胞（对照组）的增殖能力增强了21.5%（图2a）.第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期图1 线粒体成功移植入受体细胞（a，b，c）免疫荧光染色（n=3）；（d）流式细胞术分析每组受体细胞内标记线粒体的数量（显示为每个细胞的荧光强度）（n=3）Fig.1 Successful mitochondrial transplantation was tested by fluorescence staining （a，b，c） Immunofluorescence staining （n=3）；（d） Flow cytometry was used to analyze the number of labeled mitochondria in each group of recipient cells （shown as fluorescence intensity per cell）（n=3）图2 线粒体移植促进BMSCs生长，迁移，抑制凋亡（a） CCK-8分析结果（n=3）（**P<0.01）；（b）细胞凋亡染色以及DAPI细胞核染色（n=3）；（c）细胞划痕实验检测细胞迁移能力（n=3）Fig.2 Mitochondrial transplantation promoted the growth， migration and apoptosis of BMSCs （a） Results of CCK-8 analysis （n=3）（**P<0.01）；（b） Apoptosis staining and DAPI nuclear staining （n=3）；（c） Cell migration ability was detected by cell scratch assay （n=3）第 2 期杨雅丽，等： 成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷由于MSCs 在体外长期或连续传代培养后可能凋亡，本实验研究了成骨细胞线粒体移植是否可以抑制骨髓间充质干细胞的凋亡.线粒体移植后，第6~8代的细胞进行DAPI 和Annexin V -EGFP/PI 染色，观察到未转入线粒体的细胞处于凋亡晚期，转入骨髓间充质干细胞线粒体的细胞处于凋亡早期，而转入了成骨细胞线粒体的细胞未发生凋亡（图2b ）.因此，成骨细胞移植能够有效抗凋亡.骨髓间充质干细胞有足够的迁移能力才能迁移到骨缺损部位进行骨修复，为了测试受体细胞的迁移能力，本研究做了细胞划痕实验.在细胞长至融合度80%~90%时，在三个组别划同样宽度的划痕，48 h 后在倒置显微镜下观察细胞迁移情况，发现接受成骨细胞线粒体的实验组迁移能力最强，接受骨髓间充质干细胞的对照组次之，空白组迁移能力最弱（图2c ）.因此，成骨细胞线粒体移植显著促进了BMSCs 的迁移，综上结果表明其可能通过促进干细胞增殖、迁移、抗凋亡而在组织修复中发挥积极作用.3.3 成骨细胞线粒体移植提高骨髓间充质干细胞体外成骨能力Alp 、Ocn 、Opn 与Runx2是骨髓间充质干细胞成骨分化的标记基因.因此，分别在线粒体移植第4，7，14 d 进行mRNA 表达水平的RT -qPCR 检测，结果表明，随着时间的增加，转录水平增加，且第7天接受成骨细胞线粒体移植的骨髓间充质干细胞的Alp 表达水平比接受干细胞线粒体的骨髓间充质干细胞的Alp 表达水平高38.1%，Runx2表达水平提高了39.9%（图3a ）.对Runx2进行蛋白水平的Western Blot 验证，同样观察到第7天实验组中Runx2的表达水平比对照组高42.2%（图3b ）.地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸盐的化学混合物可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞.在线粒体移植后，用成骨分化培养基培养细胞14 d ，在光学显微镜下观察到细胞密度相当（图4a ，c ），随后对其进行茜素红染色和碱性磷酸酶染色（图4b ，d ），结果表明成骨细胞线粒体移植提高了骨髓间充质干细胞的体外成骨能力.3.4 成骨细胞线粒体移植减少受体细胞的ROS水平、增加ATP 生成线粒体是细胞产生能量的主要场所，为了揭示线粒体移植后细胞增殖、迁移能力和成骨分化增强的潜在机制，对成骨细胞线粒体移植后细胞ROS 水平和线粒体功能进行了检测.ROS 荧光染色结果显示，相较于空白组和对照组，移植了成骨细胞线粒体图3 成骨细胞线粒体移植促进BMSCs 成骨发育（a ） RT -qPCR 分析成骨标志基因的表达；（b ） Western Blot 检测成骨分化蛋白Runx2的表达（n =3）（*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001）Fig.3 Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes osteogenic development of BMSCs（a ） The expression of osteogenic marker genes was analyzed by RT -qPCR ； （b ） Western Blot analysis of Runx2 expression （n =3） （*P <0.05， **P <0.01， ***P <0.001）第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期的实验组细胞产生的ROS 最少（图5a ），表明移植成骨细胞线粒体有助于减少胞内ROS 水平.使用海马生物能量测定仪对三个组别进行线粒体压力水平测定，结果（图5b ）表明，移植了成骨细胞线粒体的细胞OCR （氧气消耗速率）最大，同时ATP 生成率、基础呼吸率、最大呼吸率也最高，其中实验组ATP 生成率比对照组高50.1%，实验组的基础呼吸率比对照组高71.9%，表明移植了成骨细胞线粒体的BMSCs 线粒体功能最优.结果表明，线粒体移植能够增加细胞的有氧代谢水平和线粒体ATP 的产生.图4 成骨细胞线粒体移植促进BMSCs 成骨发育（a ） 茜素红染色前显微镜下照片； （b ） 茜素红染色；（c ） 碱性磷酸酶染色前显微镜下照片；（d ） 碱性磷酸酶染色（n =3）Fig.4 Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes osteogenic development of BMSCs（a ）Microscopic photographs before alizarin red staining ； （b ） Alizarin red staining ； （c ） Microscopical photograph before alkaline phosphatase staining ； （d ） Alkaline phosphatase staining （n =3）图5 海马生物代谢仪检测线粒体功能（a ） ROS 染色；（b ） 线粒体压力检测（n =3， *P <0.05，**P <0.01，***P <0.001）Fig.5 Mitochondrial function was measured by hippocampal biometrics（a ） ROS dyeing ； （b ） Mitochondrial pressure detection （n =3， *P <0.05， **P <0.01， ***P <0.001）第 2 期杨雅丽，等：成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷4 讨论与结论本实验分别将骨髓间充质干细胞和成骨细胞的线粒体移植入受体骨髓间充质干细胞，并评估其对细胞功能变化的影响.（1）通过CCK8、细胞划痕和细胞凋亡实验可得出结论，成骨细胞线粒体移植可以显著增加体外BMSCs的增殖、迁移和抗凋亡能力.增强BMSCs的功能是优化干细胞介导的骨修复的关键，增加的增殖能力使MSCs能够在体外扩增到足够数量，用于临床移植；增强的迁移能力使MSCs能够迁移至损伤部位；抗凋亡能力使MSCs抵抗老化带来的对生存和功能的影响.（2）RT-qPCR结果表明，成骨细胞线粒体移植能够有效促进ALP等成骨相关指标基因表达水平的提高；由于OCN与OPN为分泌型蛋白，因此，我们选用位于细胞内部的Runx2作为成骨标志蛋白，Western Blot结果同样表明其含量增加；茜素红可以与钙发生显色反应，反应体外细胞钙结节沉淀情况，侧面说明成骨分化程度；ALP是成熟后成骨细胞的标识酶，成骨细胞内的ALP酶在碱性条件下能被水解成萘酚，而萘酚能与重氮盐物质结合形成不溶于水的蓝色沉淀物［18］.以上结果从基因及蛋白质等层面均证实成骨细胞线粒体移植有利于MSCs成骨分化.（3）ROS荧光染色和海马生物能量代谢仪检测线粒体压力结果表明，移植骨髓间充质干细胞线粒体的BMSCs胞内活性氧水平降低、氧气基础消耗速率较空白组上调了96.3%、ATP产量增加了80.7%，与前人的实验结果吻合［11］.同时证实移植成骨细胞线粒体较骨髓间充质干细胞线粒体的受体细胞线粒体功能更优，氧气基础消耗速率上调了71.9%、ATP产量增加了50.1%.本研究观察到干细胞功能的变化，可能有以下几个的原因.首先，细胞在体外增殖过程中需要增加耗氧量和ATP的产生，尤其是进入细胞周期后氧化磷酸化起到主导作用提供能量［19］；其次，细胞分化过程也与线粒体的含量和功能有关［20］；最后，在细胞迁移过程中需要ATP提供能量［21］.同时，已有研究表明ATP不仅能够直接提供能量，还发挥着信号转导的作用，其主要作用受体分为两类：P2X和P2Y，其中P2X受体的激活具有促进成骨的作用，而P2Y受体的激活则抑制成骨作用，它们的激活状态主要受到ATP浓度调控［22］.此外，还有研究证实ATP可以促进成骨细胞释放PGE2，导致成骨细胞钙离子的内流［23］；以及促进丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK）信号通路的激活等［24］.因此本研究推测线粒体移植通过增加细胞的有氧代谢水平和线粒体ATP的产生来增强细胞的增殖、成骨分化能力和迁移能力.然而本研究结果仍需进一步延伸.（1）虽然移植了成骨细胞线粒体的BMSCs具有更强的骨再生能力，但是否为通过激活信号通路从而促进成骨的尚待进一步研究.（2）本研究显示移植了成骨细胞线粒体的BMSCs功能优于移植了干细胞线粒体的BMSCs，对于成骨细胞线粒体和干细胞的线粒体，还未研究得到结论究竟是什么差异带来这种区别.（3）虽然成骨细胞线粒体移植有助于干细胞功能优化，而且骨髓间充质干细胞可以在体外扩增到足够的数量，在骨组织工程具有很大的潜力［22，23］，但其临床应用有待进一步载体优化.水凝胶作为一种聚合物生物材料，以其生物相容性和生物可降解性在各种治疗中输送功能性药物、分子和细胞［24］.作为缓释药物的载体，水凝胶可以保护受损区域免受不良外部刺激，保持受损部位湿润，提高药物的利用率［25，26］.设想将载有接受线粒体移植的骨髓间充质干细胞的水凝胶涂覆于骨支架表，这可能为骨缺损治疗提供了新策略.参考文献:［1］ Lee W C，Guntur A R，Long F X，et al.Energy metabolism of the osteoblast： Implications for osteo‑porosis ［J］.Endocr Rev， 2017， 38： 255.［2］Guo B L， Yang M W， Liang D，et al.Cell apoptosis induced by zinc deficiency in osteoblastic MC3T3-E1cells via a mitochondrial-mediated pathway ［J］.MolCell Biochem， 2012， 361： 209.［3］Alan T，Courtney M.Stem cell therapies in clinical trials：Progress and challenges ［J］.Cell Stem Cell，2015， 17： 11.［4］Parekkadan B， Milwid J M.Mesenchymal stem cells as therapeutics ［J］.Annu Rev 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人骨髓间充质干细胞的培养与鉴定目的分离培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs），体外观察其生长特性。
方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物。
结果纯化的hBMSCs 贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增殖能力，流式细胞仪分析P3代hBMSCs 稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73，CD90和CD105等。
结论本实验分离培养的hBMSCs具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记。
Abstract：Objective To isolate and culture human bone marrow derived mesenchymal stem cells（hBMSCs），and to observe biological characteristics of hBMSCs. Methods Bone marrow mononuclear cells were separated by the method of density gradient centrifugation and MSCs were obtained by adhere culture.The cell morphology and their growth characteristics in vitro were observed under an inverted phase contrast microscope and the cell cycles were tested by flowing cytometry. Mesenchymal like stem cells were identified by surface marker with flow cytometry.Results hBMSCs were adhered like a fibroblast morphology and with pool like growth alinement.Flow cytometry showed that the third passage cells were positive for CD73，CD90and CD105 expression.Conclusion The MSCs from bone marrow in this study show great capability of proliferation.Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells；Separation；Culture and identification间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞。
一、四种方法简介及优缺点：骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。
贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低。
此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS 贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS 贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。
密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。
梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。
Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%。
常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。
Phinney 用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问题，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。
因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。
分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。
然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。
二、具体实验流程1. 免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞：1 实验动物Sd大鼠2 试剂和仪器BSA、荧光标记小鼠抗体x、PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱。
骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养鉴定方法主要包括以下步骤：**一、分离方法**1. **差速贴壁法**：利用BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁性能差异及酶消化敏感性差异进行分离。
这种方法快速、简单、经济，但细胞纯度可能相对较低。
2. **密度梯度离心法**：基于骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选。
通过流式细胞术检测，细胞表面抗原表达CD105，CD73和CD90必须≥95%，同时表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α，或CD19和HLA － DＲ必须≤2%。
**二、培养方法**培养BMSCs的难点在于保持细胞活性。
不同种属来源的BMSCs在体外培养扩增方法基本相似，但细微的营养条件、培养环境等差异都将会对细胞性能产生影响。
**三、鉴定方法**1. **细胞形态学观察**：利用组织块贴壁法、酶消化法或其结合来分离MSC，并通过传代培养进行形态学观察。
几乎所有的MSC都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力。
MSC多数呈纤维细胞样生长，少量呈梭形或不规则三角形。
2. **表面标志物鉴定**：采用流式细胞仪对MSC的细胞表型进行鉴定。
MSC的表面抗原具有非专一性，可以同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。
MSC的细胞表面标志物鉴定标准为：CD105、CD73和CD90的阳性率≥90%；而CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR 呈阴性，阳性率≤5%。
综上所述，骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定是一个复杂的过程，涉及多个步骤和专业的技术操作。
在进行这些操作时，需要严格遵守实验规程，确保实验的准确性和安全性。
同时，对实验结果的解读也需要具备一定的专业知识和技能。
人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究赵敏;许建中;周强;王序全;秦辉;朱灏;单建林【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》【年(卷),期】2004(044)002【摘要】目的观察人骨髓问充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力.方法抽取人骨髓组织,梯度离心后,保留贴壁细胞传代,稳定传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液,通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测.结果原代人骨髓问充质干细胞10～12 d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞5～6 d即可传代,在诱导培养液中2周形成多层结构,并聚集成细胞钙化结节.诱导培养细胞碱性磷酸酶染色,骨钙素免疫组化染色阳性.结论人骨髓问充质干细胞经合理的体外诱导培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞.【总页数】3页(P1-3)【作者】赵敏;许建中;周强;王序全;秦辉;朱灏;单建林【作者单位】第三军医大学附属西南医院全军矫形外科中心,西南医院骨科,重庆,400038;第三军医大学附属西南医院全军矫形外科中心,西南医院骨科,重庆,400038;第三军医大学附属西南医院全军矫形外科中心,西南医院骨科,重庆,400038;第三军医大学附属西南医院全军矫形外科中心,西南医院骨科,重庆,400038;第三军医大学附属西南医院全军矫形外科中心,西南医院骨科,重庆,400038;第三军医大学附属西南医院全军矫形外科中心,西南医院骨科,重庆,400038;第三军医大学附属西南医院全军矫形外科中心,西南医院骨科,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】R-33【相关文献】1.兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究 [J], 张开刚;张月东;王玫2.人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达 [J], 吴欢欢;巩福星;王黔;曹谊林;肖苒3.Percoll法分离犬骨髓单个核细胞与体外成骨诱导培养的实验研究 [J], 尹宏宇;刘广鹏;崔磊;曹谊林;吕长胜4.成人骨髓间充质干细胞的体外诱导培养及向脂肪细胞的定向分化 [J], 岑航辉;韩春茂;赖平平;吕庆华5.微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较 [J], 单建林;许建中;周强;王序全;朱灏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
