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1--生物技术•遗传育种 引用格式：刘之熙，闵 军，刘三雄，等. 水稻香味基因Badh2的功能和效应分析[J]. 湖南农业科学，2023（10）：1-6. DOI:DOI:10.16498/ki.hnnykx.2023.010.001水稻（Oryza sativa L ．）是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有近 30 亿人口以水稻为主食[1]。
香米不仅在蒸煮后清香可口，更具有很高的营养价值。
同时香米在国际市场上广受欢迎，价格比非香大米高2倍以上，这也为香稻研究提供了广阔的市场前景。
香稻含有多种挥发性化合物，有学者发现直接与水稻香味相关的挥发性物质为2-乙酰1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline ，2-A'P ）[2-3]。
由于甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2功能的缺失，翻译提前终止而产生无功能的BADH2蛋白，中断了2-AP 合成底物γ-氨基丁醛的代谢，使其转而生成了香味物质2-AP [4]。
Badh2基因位于8号染色体上[5]，由 15 个外显子和 14 个内含子组成，常见的突变类型为第7外显子8 bp 缺失和3个SNP 差异导致的移码突变，以及第2外显子上7 bp 缺失造成的翻译提前终止[6-7]。
随着香味基因的克隆和香稻资源的收集，共发现有20余种badh2的等位基因[8-11]。
除了编码区 SNPs 或 InDels 引起非同义突变或移码框突变而导致无功能的BADH2蛋白产生的变异类型外，还有一些Badh2基因的变异发生在内含子区、启动子区及5'UTR 区，携带这些变异类型的水稻品种大多散发独特的香气。
笔者前期利用二代测序技术对3个香稻品种XW13、YZX 及XW17进行全基因组测序，发现3个香稻品种的Badh2基因序列一致，在编码区无明显变异的情况下，启动子区距离ATG -1487 bp 处有一个8 bp 的插入突变，这种变异类型在已测序并公开发表的76份香稻资源的Badh2基因序列中也有发现，命名为 badh2-p [12]。
文献译文RNA干涉定向下调OsBADH2导致在水稻中2-乙酰-1-吡咯啉的形成Xiangli Niu, Wei Tang, Weizao Huang, Guangjun Ren, Qilin Wang, Di Luo, Yingyong Xiao, Shimei Yang, Feng Wang, BaoRong Lu, Fangyuan Gao, Tiegang Lu, and Yongsheng Liu摘要背景：香米因其独特的的香味风靡全球，基因研究和物理遗传精细定位揭示了一个同源的甜菜碱脱氢酶候选基因（fgr/OsBADH2），是在香稻的新陈代谢中起作用，但是缺乏直接证据证明OsBADH2的功能。
为了阐明OsBADH2的生理作用，测序方法和RNA干扰（RNAi）技术的应用到了香味组分分析等位基因变异和OsBADH2基因功能。
半定量RT - PCR以及气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分别用在野生型和转基因OsBADH2 RNA干扰抑植株中以确定OsBADH2表达水平和芳香化合物成分。
结果：结果表明，多样性突变同样的fgr等位基因存在于中国各地的均有种植的13香上; OsBADH2基本表达，伴随着在成熟根系里的低表达丰度；通过RNA干扰破坏OsBADH2基因能导致2 - 乙酰基-1 - 吡咯啉成分显著增加。
结论：我们发现改变OsBADH2基因表达水平，会影响香味组分的积累，同时普遍存在的香味等位基因可能有一个单一的进化起源。
背景香稻的独特的香味导致其风靡全球[1、2]，芳香特性使得其广泛纳入商业和杂交水稻育种项目[ 3-5]。
在香稻品种香味的发散已被证明是与2-乙酰-1-吡咯啉(下文简称：2AP)的存在是联系在一起的[6] ，同时被鉴定为存在于非常多的食品中[7 ]。
在泰国香稻品种Khao Dawk Mali 105中，2AP的形成和强烈的香味散发与脯氨酸积累呈正相关[8]。
尽管导致香味产生的生化途径还是个未知数，但是在稻科植物中L-脯氨酸已被证明可能是2AP的前体[9]。
水稻香味的研究与应用张羽 (陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西汉中723000)摘要 对香稻的分类、香味物质的分析、香味的鉴定方法及其遗传育种研究现状作一综述。
关键词 香稻;研究;应用中图分类号 S511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)33-14471-03基金项目 陕西省教育厅专项科研项目(08J K252);陕西理工学院专项科研基金项目(SLG0628)。
作者简介 张羽(1968-),女,陕西汉中人,硕士,副教授,从事遗传学理论与实践等方面的教学和科研工作。
收稿日期 2008-09-22 香稻作为水稻家族中的特殊成员,其栽培历史相当悠久,世界上各水稻生产国或地区几乎都有香稻种植,普遍分布在东南亚和南亚地区,主要在印度、巴基斯坦、中国台湾、孟加拉国、阿富汗、伊朗、中国和美国。
国际市场上著名的香米品种主要有印度和巴基斯坦的Basmati 、Basmati 370,泰国的KD ML105、Jas mine 、R D6、Sia mati ,阿富汗的Bahra ,伊朗的Sadri 及美国的D ella 、T exa ma ti 、kasmati 等,中国的香稻资源也很丰富,如陕西的洋县香米、湖南的江永香米、福建的过山香米、山东的曲阜香稻等。
香米在中国古代就享有“贡米”之称,其国际市场价格远高于非香米,是非香稻优质米的2～3倍。
目前,香稻米因其具有独特的香味特征而备受广大消费者的喜爱,被视为稻米中的珍品。
因此,香稻育种已成为水稻遗传育种的重要内容之一,对水稻香味的研究成为了现阶段香稻育种的热点。
1 香稻的分类和常规稻一样,香稻也可分为籼亚种和粳亚种,再进一步可将香稻品种分为4大类:籼型香稻米、粳型香稻米、籼糯型香稻米、粳糯型香稻米;按色泽可分为白色、黑色、紫色;按粒型分为长粒型和短粒型;按株高可分为高秆型和矮秆型;按散发的气味可分为爆米花香型、紫罗兰香型、茉莉花香型、山核桃香型、烤面包香型等,如Della 、KD ML 105、Ba sma ti370,中国的中香1号、香粳8618、香玉糯等具有爆米花香型。
收稿日期：2023-09-11基金项目：岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心基金资助课题（2022KF003）；广东省普通高校创新团队项目（2021KCXTD029）作者简介：梁雪雨（1995-），女，在读博士生，研究方向为作物遗传育种，E-mail：****************通信作者：杨瑰丽（1977-），女，博士，助理研究员，研究方向为作物遗传育种，E-mail：***************.cn广东农业科学2023，50（12）：104-111Guangdong Agricultural SciencesDOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.12.010梁雪雨，郭敏，欧旭华，陈莹，周丹华，黄翠红，王慧，杨瑰丽. 南方稻区主栽香稻品种香味基因Badh2基因型分析［J］. 广东农业科学，2023，50（12）：104-111.南方稻区主栽香稻品种香味基因Badh2基因型分析梁雪雨1, 2，郭 敏1,2，欧旭华2，陈 莹2，周丹华2，黄翠红2，王 慧2，杨瑰丽1, 2（1. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525099；2. 华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心，广东 广州 510642）摘 要：【目的】香味是水稻重要的品质性状之一，直接影响消费者对稻米蒸煮食味的感官评价。
香稻资源的筛选和香味基因的鉴定与利用对香稻遗传育种以及香稻产业发展具有一定的实践意义。
Badh2是目前已被克隆的控制水稻香味的主效基因，明确该基因不同突变类型在南方地区香稻主栽品种中的分布与利用程度，可更好地服务于南方稻区的香稻育种研究。
【方法】利用香味基因Badh2的KASP 功能性分子标记，对30份南方香稻主栽品种Badh2进行基因分型分析，并采用咀嚼法、KOH 浸泡法、HS-SPME/GC-MS 联用技术对以上香稻品种进行香味表型鉴定，同时对主栽香稻品种的香源亲本进行溯源分析。
48份水稻骨干材料香味及Badh2变异类型的鉴定张倩倩;殷春渊;刘贺梅;胡秀明;孟利红;王和乐;张金霞;田芳慧;袁泽科;孙建权;王书玉【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2024(43)1【摘要】为促进香稻育种,明确水稻重要种质资源中香味基因的存在情况,本研究将传统香味鉴定方法(KOH浸泡法)与分子标记技术相结合,对48份水稻骨干材料的香味及香味基因Badh2变异类型进行鉴定。
结果表明,在48份供试材料中,利用KOH浸泡法检测到具有香味的材料有44份;利用香味基因Badh2的7种等位基因变异类型功能标记检测到含有香味的材料有43份,其中,有41份为纯合香型,2份为杂合型,等位基因Badh2-E2的变异类型有37份,等位基因Badh2-E7的变异类型有6份,未检测到等位基因Badh2-E4-5、Badh2-E12、Badh2-E13、Badh2-UTR 和Badh2-Pro的变异类型。
通过比较KOH浸泡法与分子标记技术,发现仅有1份材料检测结果不同,明水香稻(X23)用KOH浸泡法检测出具有香味,但本研究所用的Badh2的7种等位基因变异类型功能标记却未检测出含有香味,说明该材料可能属于Badh2其他已报道的或新的等位基因变异类型,也可能是含有新的香味基因。
【总页数】7页(P107-113)【作者】张倩倩;殷春渊;刘贺梅;胡秀明;孟利红;王和乐;张金霞;田芳慧;袁泽科;孙建权;王书玉【作者单位】新乡市农业科学院;获嘉县亢村镇政府;河南省驻马店农业学校【正文语种】中文【中图分类】S511【相关文献】1.利用CRISPR/CAS9技术编辑水稻香味基因Badh22.利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh23.编码甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2抑制了水稻香味的来源主要组分2-acetyl-1-pyrroline(2-AP)的生物合成4.9个广西常规香稻品种香味及香味基因变异类型分析5.水稻香味基因Badh2的功能和效应分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
水稻香味的遗传研究进展
杨扬;谢震泽;王轲;晏月明
【期刊名称】《首都师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2010(031)003
【摘要】香米在国际稻米贸易市场上占有重要的地位,成为当今科研热门课题之一,而香味是香稻最重要的品质特性.普遍认为香味是单基因隐性遗传的,由第8染色体编码BADH2的基因碱基部分缺失而产生,香味表达是基因与环境相互作用的结果.本文主要综述了近年来水稻香味的研究进展,主要包括香味的类型、香味的主要化学成分-2-乙酰-1-吡咯啉及其遗传与表达、香味常用的鉴定方法以及香味基因的分子标记与定位等,并对存在的问题进行了分析与展望.
【总页数】6页(P24-29)
【作者】杨扬;谢震泽;王轲;晏月明
【作者单位】首都师范大学生命科学学院,北京,100048;首都师范大学生命科学学院,北京,100048;首都师范大学生命科学学院,北京,100048;首都师范大学生命科学学院,北京,100048
【正文语种】中文
【中图分类】Q37
【相关文献】
1.水稻稻米香味基因的遗传研究及其在育种中应用的研究进展 [J], 郭震华;张淑华;刘传雪;王瑞英;张兰民;关世武;黄晓群
2.京香2号水稻香味的遗传分析与SSR标记定位 [J], 马利奋;李培富;高颖银;杨淑琴;马宏玮
3.水稻香味基因的遗传和研究进展 [J], 张俊宝;潘惠文;刘海英;
4.利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味品质进行遗传改良 [J], 周俊飞; 高利芬; 汪伟航; 陈利红; 方治伟; 李论; 李甜甜; 彭海
5.五优稻4号水稻香味的遗传分析与SSR分子标记筛选 [J], 刘海英;杨忠良;刘会;冷春旭;吴立成;徐振华;于艳敏;来永才
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作者简介杨占烈（１９７１－），男，贵州凯里人，硕士，副研究员，从事水稻遗传育种研究。
收稿日期２００７!０７!２５目前许多研究表明，水稻香味基因（ｆｒｇ）是位于第８染色体上，并且是由一对隐性基因控制［１－３］，其芳香化学成分主要是２!乙酰基!１!吡咯啉［４－８］。
香和非香之间的差异不在于２!乙酰基!１!吡咯啉的有无，而在于含量的多少，其在香稻品种中的含量明显高于非香稻品种［５，７，９］。
Ｌｏｕｉｓ等认为，处于第８染色体上的ＢＡＤＨ２基因与香味有关联，香与不香基因则类似于缺失了８个碱基对的ＢＡＤＨ２基因和完整的ＢＡＤＨ２基因，缺少（或受抑制）８个碱基对的香味基因能促进芳香物质２!乙酰基!１!吡咯啉的积累［１，１０］。
对香味基因的鉴定大多应用ＲＧ２８、ＲＭ２１０、ＲＭ５１５、ＲＧ１等分子标记鉴定［３，１１－１３］，在国内利用ＢＡＤＨ（甜菜碱醛脱氢酶）对水稻香味基因作检测的报道不多，而大部分是应用在耐盐和抗旱的生理研究上［１４－１６］。
通过合成ＢＡＤＨ引物，对样本ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测香味基因是很有效的方法之一。
２００７年笔者在泰国卡色萨大学ＤＮＡ实验室参与了其香稻品种改良研究的一些工作，利用ＢＡＤＨ引物对泰国香稻的回交后代材料ＢＣ３Ｆ２和来源于我国的香稻进行了香味基因的检测。
１材料与方法１．１材料１．１．１ＢＡＤＨ引物。
由泰国卡色萨大学（ＫａｓｅｔｓａｒｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ＫａｍｐａｅｎｇＳｅａｎ校区的ＤＮＡ技术实验室研制合成，定位于第８染色体上，分为正向和反向引物（引物序列未对外公开），是应用于ＰＣＲ分子标记检测香味基因的特殊引物，经过ＰＣＲ反映香和非香水稻ＤＮＡ均能获得扩增产物，但扩增产物香比不香分子量（２４８ｂｐ）少８ｂｐ，能很好地鉴别出纯合与杂合香味基因。
１．１．２供试水稻。
泰国香稻ＫＤＬＭ１０５和柬埔寨无香味耐旱品种ＰＲＤ以及它们的回交后代ＢＣ３Ｆ２；印度香稻Ｂａｓｍａｔｉ、０４Ｈ２００９株系材料（贵州地方品种×新香Ｂ的杂交后代）和Ｇ１５６Ｓ（没有香味）。
１．２方法１．２．１香味鉴定。
试验在泰国卡色萨大学（ＫａｓｅｔｓａｒｔＵｎｉｖ!ｅｒｓｉｔｙ）ＫａｍｐａｅｎｇＳｅａｎ校区进行，在试验田种植所有待检测香味基因的单株材料，其中有９４份ＫＤＬＭ１０５与ＰＲＤ杂交后的回交后代ＢＣ３Ｆ２。
于５叶期分别对各单株取叶片进行实验室ＤＮＡ提取，后向各ＤＮＡ样品中加入ＢＡＤＨ引物进行ＰＣＲ扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染后检测ＤＮＡ内是否含有香味基因。
同时，对显示含香味基因的单株利用ＫＯＨ溶液作叶片香味鉴定。
抽穗前取每单株上部叶片２ｇ，剪成０．２ｃｍ长的碎片放在直径３～５ｃｍ、长１０ｃｍ的试管中，加入１０ｍｌ浓度１．７％ＫＯＨ溶液，盖上玻璃塞在室温下放置１０ｍｉｎ，然后闻其香味，并比较两种检测结果是否吻合。
１．２．２ＤＮＡ提取。
取供试材料５叶期幼苗叶片１ｇ，在１．５ｍｌ的离心试管中用液氮迅速研磨粉碎后加入１０００μｌ１．５×ＣＴＡＢＢｕｆｆｅｒ（１５ｇＣＴＡＢ，７５ｍｌ的浓度１ｍｏｌ／ＬＴｒｉ!ＨＣｌ，３０ｍｌ的浓度０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，２１０ｍｌ的浓度５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，６８５ｍｌ的ｄＨ２Ｏ），在６５℃下温育１ｈ，适当颠倒１～２次，放入冰块内冷却５ｍｉｎ，然后加等体积的氯仿∶异戊醇（２４∶１），轻轻摇匀，离心１０ｍｉｎ（１２０００ｒ／ｍｉｎ），取上清液用异丙醇沉淀，用浓度７０％的乙醇轻洗２次，勾出ＤＮＡ，吹干后加入适量的１×ＴＥ溶解保存备用。
１．２．３ＰＣＲ扩增与电泳。
（１）ＰＣＲ反应体系。
取上述不同基因型材料的ＤＮＡ作ＢＡＤＨ引物检测水稻香味基因的研究杨占烈（贵州省农业科学院水稻研究所，贵州贵阳５５０００６）摘要［目的］为了检测水稻中的香味基因，为其在香稻选育中的应用提供依据。
［方法］从泰国香稻的回交后代材料ＢＣ３Ｆ２和中国的香稻中提取ＤＮＡ后，加入ＢＡＤＨ引物进行ＰＣＲ扩增，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测香味基因。
同时，对含香味基因的单株利用ＫＯＨ溶液作叶片香味鉴定，并比较两种检测结果。
［结果］电泳结果表明，９４份样品中有３２份样品含有纯合的香味基因，１９个样品为香味基因的杂合体，与ＫＯＨ溶液法检测香味的结果一致。
ＢＡＤＨ引物ＰＣＲ扩增结果表明，香味来源于新香Ｂ的后代材料能产生明显的ＤＮＡ扩增带，其香味基因与ＫＤＬＭ１０５以及Ｂａｓｍａｔｉ香稻品种的香味基因均位于第８染色体上，属于等位基因。
［结论］在香稻品种选育中，利用ＢＡＤＨ引物能准确检测出含香味基因的植株，显著地缩短香稻品种育成的年限。
关键词ＢＡＤＨ；检测；水稻香味基因；香稻选育；应用中图分类号Ｑ７８文献标识码Ａ文章编号０５１７－６６１１（２００７）３５－１１３９０－０２ＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＡｒｏｍａＧｅｎｅｓｉｎＲｉｃｅｂｙＵｓｉｎｇＢＡＤＨＰｒｅｍｉｅｒａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＦｒａｇｒａｎｔＲｉｃｅＹＡＮＧＺｈａｎ!ｌｉｅ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｉｃｅ，ＧｕｉｚｈｏｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５５０００６）Ａｂｓｔｒａｃｔ［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｉｍｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅａｒｏｍａｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｂａｓｉｓｆｏｒｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｆｒａｇｒａｎｔｒｉｃｅ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＡｆｔｅｒＤＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｂａｃｋｃｒｏｓｓｐｒｏｇｅｎｙｍａｔｅｒｉａｌｓＢＣ３Ｆ２ｏｆＴｈａｉｌａｎｄｆｒａｇｒａｎｔｒｉｃｅａｎｄＣｈｉｎｅｓｅｆｒａｇｒａｎｔｒｉｃｅ，ＢＡＤＨｐｒｅｍｉｅｒｗａｓａｄｄｅｄｆｏｒＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅａｒｏｍａｇｅｎｅｓｂｙｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ａｒｏｍａｏｆｌｅａｆｂｌａｄｅｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｏｎｔｈｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐｌａｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｅｄａｒｏｍａｇｅｎｅｓｂｙｕｓｉｎｇＫＯＨｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｍｏｎｇ９４ｓａｍｐｌｅｓ，３２ｓａｍｐｌｅｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓａｒｏｍａｇｅｎｅｓａｎｄ１９ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅｓｏｆａｒｏｍａｇｅｎｅｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｃｃｏｒｄａｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇａｒｏｍａｂｙＫＯＨｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＢＡＤＨｐｒｅｍｉｅｒｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｇｅｎｙｍａｔｅｒｉａｌｓｔｈａｔａｒｏｍａｒｏｏｔｅｄｉｎＸｉｎｘｉａｎｇＢｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅｏｂｖｉｏｕｓＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂａｎｄｓ，ｗｈｏｓｅａｒｏｍａｇｅｎｅｓａｎｄｔｈｅａｒｏｍａｇｅｎｅｓｉｎＫＤＬＭ１０５ａｎｄＢａｓｍａｔｉｆｒａｇｒａｎｔｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓａｌｌｌａｙｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ａｎｄｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏａｌｌｅｌｅｓ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｉｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｆｒａｇｒａｎｔｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ｕｓｉｎｇＢＡＤＨｐｒｅｍｉｅｒｃｏｕｌｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｐｌａｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｅｄａｒｏｍａｇｅｎｅｓｅｘａｃｔｌｙａｎｄｓｈｏｒｔｅｎｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆｆｒａｇｒａｎｔｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＢＡＤＨ；Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ；Ａｒｏｍａｇｅｎｅｉｎｒｉｃｅ；Ｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｆｒａｇｒａｎｔｒｉｃｅ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ安徽农业科学，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００７，３５（３５）：１１３９０－１１３９１，１１３９３责任编辑张杨林责任校对王淼为模板进行ＰＣＲ扩增，总体积１０μｌ，其中ＭｇＣｌ２浓度２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１．０μｌ，１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ１．０μｌ，ｄＮＴＰｓ（浓度１ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μｌ，正反向引物分别为０．５μｌ，模板ＤＮＡ２．０μｌ，ｄＨ２Ｏ２．９μｌ，Ｔａｑ．ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（浓度１Ｕ／μｌ）０．１μｌ。
（２）ＰＣＲ反应条件。
９４℃预变性３ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存。
（３）ＰＣＲ产物的检测。
采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行。
其配方为：５０ｍｌ浓度４．５％丙烯酰胺凝胶，３５０μｌ浓度１０％ＡＰＳ和７０μｌＴＥＭＥＤ。
电泳缓冲液为１×ＴＢＥ，６０Ｗ恒功率，５０℃条件下电泳２ｈ，约到达１７ｃｍ处结束，进行硝酸银染色。
（４）银染程序。
将凝胶用浓度１０％的醋酸在黑暗条件下固定３０ｍｉｎ后用蒸馏水漂洗３次，每次２ｍｉｎ；置染色液（每升染色液含１ｇ硝酸银和１．５ｍｌ浓度３７％甲醛）中染色３０ｍｉｎ；再用蒸馏水漂洗数秒并迅速显影（每升显影液含３０ｇ碳酸钠、２０μｌ的１００ｍｇ／ｍｌ硫代硫酸钠和１．５ｍｌ浓度３７％甲醛），需预冷至１２℃，最后用浓度１０％的醋酸固定，用蒸馏水漂洗５ｍｉｎ后照相并保存。
２结果与分析２．１ＤＮＡ产物提取的ＫＤＬＭ１０５、Ｂａｓｍａｔｉ、０４Ｈ２００９和Ｇ１５６Ｓ的ＤＮＡ经琼脂糖凝胶电泳后的浓度显示结果见图１，图中的ＤＮＡ条带清晰，浓度２０￣５０ｎｇ／μｌ，能进一步进行ＰＣＲ反应。
高浓度ＤＮＡ有利于ＰＣＲ扩增效果（ＢＣ３Ｆ２植株的ＤＮＡ产物浓度检验图略）。
２．２ＢＡＤＨ引物ＰＣＲ扩增及电泳、银染结果（１）用ＢＡＤＨ引物对９４份ＫＤＬＭ１０５与ＰＲＤ杂交后的回交后代ＢＣ３Ｆ２样本ＤＮＡ作ＰＣＲ扩增，经电泳、银染后结果见图２。
图２表明，有４１个样品与非香亲本ＰＲＤ具有相同的扩增带，即该类植株不含香味基因；有３２个样品与香稻亲本ＫＤＬＭ１０５具有相同的扩增带，说明这些植株含有纯合的香味基因；有１９个样品同时具有双亲的扩增带，说明这些植株为香味基因的杂合体；另两个样品看不见扩增产物，原因不明。
（２）采用ＫＯＨ溶液处理叶片闻香法，对上述３２个经过ＢＡＤＨ引物检测并具有香味基因的植株进行验证，３次重复，结果显示都能不同程度地散发出香味。
这说明了利用ＢＡＤＨ引物来检测香味基因的可靠性和准确性。
