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抗除草剂转基因玉米的快速鉴定方法作者：王莹袁英来源：《江苏农业科学》2014年第04期摘要：以含不与除草甘膦结合的突变型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因除草剂筛选标记的转基因玉米为材料，通过叶片喷雾和叶片离体平板培养等试验，建立快速非分子生物学抗除草剂转基因玉米的鉴定方法。
结果表明：用5 000 mg/L草甘膦叶片喷雾和用70 mg/L草甘膦叶片离体培养可快速准确地鉴定是否转入除草剂基因。
关键词：转基因玉米；抗除草剂；草甘膦；鉴定方法中图分类号： S513.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0054-03收稿日期：2013-08-15基金项目：吉林省财政厅育种项目。
作者简介：王莹（1982—），女，吉林长春人，硕士，讲师，从事生物技术方向研究。
Tel：（0431）84602461；E-mail：grammy1981@。
通信作者：袁英，硕士，研究员，从事作物遗传转化研究。
Tel：（0431）87063098；E-mail：32854085@。
随着转基因作物商业化生产的发展，转基因作物种植面积从1996年的170万hm2增加到2012年的1.7亿hm2，增长了99倍，这是前所未有的突破，其中抗除草剂作物种植面积最大[1]。
在植物转基因研究过程中，通常采用选择性标记基因提高筛选效率，而除草剂基因是较常用的筛选标记基因，而5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）基因最常用。
目前，国际上种植面积最大的抗除草剂转基因玉米是转EPSPS基因抗农达除草剂玉米[2]。
近几年，国内对抗除草剂转基因玉米和抗除草剂筛选方法的研究也取得了很大的成功[3-11]。
在转基因研究和安全评价等过程中对转基因植株的鉴定是必不可少的环节[12]，传统上初步鉴定转基因的方法是利用聚合酶链反应（PCR）鉴定目的基因DNA片段是否存在；但是PCR方法步骤繁琐，做大量鉴定运用时有一定的局限性。
利用筛选标记基因的农艺性状，建立快速有效的非生物鉴定方法非常必要。
山地农业生物学报27(5):382~388,2008Jour nal of M oun tai n Agricu lture and B iology农杆菌介导转化愈伤组织获得抗除草剂转基因玉米植株*朱友银1,2,冯怡1,2,赵德刚1,2*(1.贵州大学生命科学学院贵州省农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025;2.贵州大学教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室,贵州贵阳550025)摘要:对4个玉米基因型Q31@Z31、Q31@Z3、Z3、B73胚性愈伤组织进行农杆菌介导基因转化,根据G us基因表达水平,研究了影响农杆菌介导遗传转化玉米愈伤组织的因素。
结果表明,在选用的玉米基因型中,不同基因)为型转化效率存在显著差异,其中Q31@Z31、Q31@Z3、B73转化效率较高,Z3较低。
农杆菌菌液浓度(OD6000.4~0.6、侵染时间为10m i n、23e暗培养3d是较佳转化条件。
通过农杆菌介导遗传转化,获得再生玉米植株,并对再生植株离体叶片进行除草剂抗性检测,发现转基因再生植株叶片可以抵抗200mg/L B asta。
关键词:玉米愈伤组织;农杆菌;遗传转化;G us基因;Pat基因中图分类号:S513;Q789文献标识码:A文章编号:1008-0457(2008)05-0382-07Callus Transfor m ation of A grobac t eriu m-m ediated and P lants R esistant to Herbicide i n Zea m ays L.Z H U You-y in1,2,FEN G Y i1,2,ZHA O D e-gang1,2*(1.Gu izhou K e y Laboratory of A gro-B ioengineer ing,C olleg e of L i f e Sciences,G uizhou Un iver sity,G uiyang Gu izhou550025,Ch ina;2.K ey L abo ra tory of Green P esticide andA gr icu lturalB io eng ineering,M i n istry of Educa tion,Guizhou Un ivers ity,Gu i y ang G i zhou550025,China)Abstrac t:In t h i s report,four g enotypes of m a i ze(Z ea may s L.)e mbryon ic ca lliw ere transfor m ed v ia Ag robacter i u m tu-m efac i ens.T he expression leve l of B-g l ucuron i dase(G us)g ene was used as the ev al uation index of infl uenc i ng trans-for m ati on e fficiency.T he resu lts sho w ed that there w as do m i nan t d ifference a m ong differentm a ize geno types.The hybri d li ne Q31@Z31、Q31@Z3and li ne B73w ere m ore sensiti ve than li ne Z3.I mproved transf o r m ati on effi c i encies w ere ob-=0.4~0.6)for10m i n i n ta i ned when the e m bryonic ca lliw ere incubated w it h A grobacter i u m suspensi on cells(OD600the infecti on m edi um.O pti m ized co-culture cond iti on w as tha t infecti on w as per f o r m ed at23e i n dark f o r3days.The transgenic ma ize plan ts w ith basta-resistant w ere obta i ned v ia Ag robacter i u m-med i ated transfor m a ti on.K ey word s:M a ize(Zea m ays L.);Embryon ic ca ll;i A grobactcri u m tu m efac iens;G ene ti c transfor m a tion;G us g ene;P at gene玉米Zea m ays L.是重要的粮食作物,也是重要的工业原料。
高中生物专项训练试题汇编47：基因工程1．获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如图。
为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是()①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同A．①③B．①④C．②③D．②④答案：A解析：为了防止Ti质粒被切成多个片段而失去应有功能，每种限制酶只有一个酶切位点，①正确；若编码蛋白质的序列中，有限制酶酶切位点，会使序列不能合成蛋白质，②错误；酶切后形成的黏性末端不同，保证了G基因不发生自身环化，③正确；若形成的黏性末端序列相同，会使Ti质粒发生自身环化，④错误，因此选择的原则是①③，故A项正确。
2．用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。
以下叙述不正确的是()A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图2中酶切产物可用于构建重组DNAC．泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA答案：D解析：分析图1可知，XhoⅠ有2个酶切位点，SalⅠ有3个酶切位点，这些酶切位点不重合，所以图1中两种限制酶识别的核苷酸序列不同，故A项正确，不符合题意。
图2中的酶切产物可与用同种限制酶处理的载体构建重组DNA，故B项正确，不符合题意。
由图2可知，泳道①得到了四种酶切产物，说明泳道①是由具有3个酶切位点的酶处理后得到的，即用SalⅠ处理得到的酶切产物，故C项正确，不符合题意。
限制酶识别的是双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA，不是识别单链DNA，故D项错误，符合题意。
3．(经典题，6分)如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
以下相关叙述，正确的是()A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异答案：D解析：构建表达载体需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，故A项错误。
2023年高考生物模拟试卷注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、准考证号、考场号和座位号填写在试题卷和答题卡上。
用2B铅笔将试卷类型（B）填涂在答题卡相应位置上。
将条形码粘贴在答题卡右上角"条形码粘贴处"。
2．作答选择题时，选出每小题答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目选项的答案信息点涂黑；如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案。
答案不能答在试题卷上。
3．非选择题必须用黑色字迹的钢笔或签字笔作答，答案必须写在答题卡各题目指定区域内相应位置上；如需改动，先划掉原来的答案，然后再写上新答案；不准使用铅笔和涂改液。
不按以上要求作答无效。
4．考生必须保证答题卡的整洁。
考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。
)1．研究发现，癌细胞表面的PD-L1 蛋白可与T 细胞表面的PD-1 蛋白结合，导致T 细胞不能全面启动对癌细胞的免疫攻击，使用抗PD-1 抗体可使癌症患者的肿瘤快速萎缩。
叙述正确的是（）A．癌细胞的清除体现了免疫系统的监控和清除功能B．PD-L1 蛋白和PD-1 蛋白结合，这体现了细胞膜的选择透过功能C．PD-L1 蛋白和PD-1 蛋白均可与抗PD-1 抗体结合D．癌症患者体内的PD-1 蛋白表达不足会降低机体细胞免疫的能力2．下列有关细胞共性的叙述，正确的是A．都具有细胞膜但不一定具有磷脂双分子层B．都具有细胞核但遗传物质不一定是DNAC．都能进行细胞呼吸但不一定发生在线粒体中D．都能合成蛋白质但合成场所不一定是核糖体3．如图表示母亲年龄与生育后代先天愚型病发病风险曲线，下列叙述错误的是（）A．图中45岁女性所生子女数目少的可能原因之一是体内雌激素含量低B．遗传病在人体不同发育阶段的发病风险中，先天愚型病在成年阶段发病率很低C．图中先天愚型病的诊断只能通过羊膜腔穿刺D．图中两条曲线的结果告诉我们应提倡适龄生育4．肺炎双球菌的转化实验分为格里菲斯的体内转化实验和艾弗里的体外转化实验，下列有关叙述错误的是（）A．格里菲斯认为加热杀死的S型细菌中含有某种基因使R型活细菌转化为S型活细菌B．格里菲斯体内转化实验没有证明DNA是遗传物质C．艾弗里认为DNA是使R型细菌产生稳定遗传变化的物质，即DNA是遗传物质，而蛋白质不是遗传物质D．艾弗里最关键的实验设计思路是设法把DNA与蛋白质分开，单独地、直接地去观察DNA或蛋白质的作用。
抗草甘膦基因的玉米转化及后代遗传分析王秀红;史向远;白建荣;孙毅;刘惠民【摘要】利用农杆菌介导法将一个新型抗草甘膦基因导入玉米优良再生材料Hi-II 中,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在15株T0转基因植株中有10株,经PCR初步检测呈阳性;T1转基因植株用2%草甘膦进行抗筛选性后,4个穗行符合3:1的遗传分离比,3个穗行符合1:1的遗传分离比.对35个T2转基因植株以株系为单位混收进行PCR检测,结果表明,有32个T2株系表现阳性.对籽粒色泽纯度高且呈阳性的株系依次进行田间草甘膦涂抹、PCR和RT-PCR检测,结果显示,田间草甘膦筛选效果明显,植株全部存活,选10株PCR呈阳性的植株进行RT-PCR 检测,9株出现1.2 kb的目的条带,说明抗草甘膦基因能够遗传至T2且能有效进行转录和翻译.%A new glyphosate-resistant gene was introduced into Hi-Ⅱ by Agrobacterium-mediated transformation,the To transformation and progeny genetics were analyzed. Ten plantlets were positive by PCR analysis from fifteen T0 transformed plants. After being painted with 2％glyphosate for 14 days,four spike lines accorded with 3:1 Mendelian segregation ratio and three spike lines accorded with 1:1 segregation ratio in T1. 32 spikes lines were positive by PCR from 35 T2 transformed plants. The spikes lines with high purity grain were selected to further glyphosate painting,PCR and RT-PCR analysis and all plants survived after glyphosate painting and 1.2 kb bands were obtained in nine from ten positive plants. The results showed that glyphosate-resistant gene was able to inherit to the T2 progeny,and transcribed and translated effectively.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2011(026)001【总页数】5页(P117-121)【关键词】抗草甘膦基因;玉米;遗传分析【作者】王秀红;史向远;白建荣;孙毅;刘惠民【作者单位】山西大学,生命科学与技术学院,山西,太原,030006;山西省农业科学院,现代农业研究中心,山西,太原,030031;山西省农业科学院,现代农业研究中心,山西,太原,030031;山西省农业科学院,作物遗传研究所,山西,太原,030031;山西省农业科学院,山西,太原,030006;山西省农业科学院,山西,太原,030006【正文语种】中文【中图分类】Q786草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,glyphosate)因其价格低廉、低毒性和有效的广谱除草特性,已成为农业生产上应用较多的除草剂，此外，抗草甘膦作物的培育成功也是其成为全世界利用率最高的化学除草剂的原因之一[1]。
转基因技术在玉米育种中的运用作者：王良发张守林卢瑞乾李长建李风章王静张素芬来源：《安徽农业科学》2014年第31期摘要就玉米转基因在抗除草剂、抗虫、抗病、抗盐碱等方面取得的成果进行了回顾，以期为我国玉米分子育种研究提供参考。
关键词玉米；转基因；非生物胁迫；分子育种中图分类号 S512 文献标识码A 文章编号 0517-6611（2014）31-10875-02Application of Transgene in Maize BreedingWANG Liangfa， ZHANG Shoulin， LU Ruiqian et al （Maize Research Center， Hebi Academy of Agricultural Sciences， Hebi， Henan 458030）Abstract The achievements of transgenic maize in herbicide resistance， insect resistance，disease resistance and alkali resistance were reviewed. It would be helpful for scientists who are working on the study of molecular breeding of maize in China.Key words Maize； Transgene； Abiotic stress； Molecular breeding玉米是人类重要食物之一，在过去的几十年里，传统杂交育种为人类粮食生产作出了巨大贡献。
但随着人口数量的剧增，传统育种技术已不能满足人类对食物、能源等的需求。
转基因技术因能在较短时间内生产人们所需的生物性状而迅速发展。
据专家预测，到2030年，全球50%的农产品将由转基因技术提供[1]。
笔者就玉米转基因在抗除草剂、抗虫、抗病、抗盐碱等方面的成果进行了回顾，以期为我国玉米分子育种研究提供参考。
专题21（押江苏卷非选择题）基因工程从近几年的新课标卷的考查知识点来看，第23题主要考查基因工程知识。
基因工程的流程和应用是高考的必考点，且常考常新，预计2022年高考也不例外，依然会对其进行考查，有可能与新的科研实事结合，综合考查基因工程的流程和应用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细胞工程、胚胎工程等综合起来考查。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。
能够结合背景材料分析问题、解决问题。
从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。
把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象1．（2021江苏高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag 标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：(1)目的基因的扩增①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致______。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有______A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性(2)重组质粒的构建①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进______，形成A-m结合体。
将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及______酶等，完成质粒的环化。
抗除草剂的玉米的育种原理抗除草剂是一类可以抑制杂草生长的化学物质，常用于农田中，以防止杂草对庄稼的竞争和危害。
而抗除草剂对玉米的育种原理则是通过修改玉米的基因组，使其对抗除草剂具有耐受性。
以下将详细介绍抗除草剂对玉米育种的原理。
抗除草剂对玉米的育种主要基于转基因技术。
转基因是将具有特定基因的外源DNA导入到目标生物体中，以改变其遗传特性和表现形态。
在玉米育种中，通过转基因技术将抗除草剂耐受基因导入玉米中，使其能够耐受抗除草剂的作用。
首先，育种学家会选择适应于当前种植环境和需求的玉米品种。
然后，从相对抗除草剂的植物中，如拟南芥、水稗等，筛选出具有抗除草剂耐受基因的候选基因。
常用的抗除草剂耐受基因有PAT、BAR、EPSPS等。
接下来，在实验室中，将筛选出的抗除草剂耐受基因进行基因克隆和基因表达载体的构建。
基因克隆包括将抗除草剂耐受基因从基因供体中分离出来，并通过PCR技术扩增基因片段。
构建基因表达载体则是将基因片段连接到合适的载体上，载体可以是植物转化载体如Ti质粒。
然后，将构建好的基因表达载体导入到玉米胚培养体细胞中，使用冲击法或冷冻法使基因表达载体进入胚培养体细胞质内。
通过选择性培养基对转化细胞进行筛选和再生，最终获得转基因抗除草剂耐受的玉米植株。
转基因抗除草剂耐受的玉米植株经过鉴定合格后，可以进行田间试验和繁育工作。
首先，在小面积的农田试验中，通过对转基因抗除草剂耐受的玉米和普通玉米进行施药观察，验证转基因玉米对抗除草剂的耐受性。
如果转基因玉米在抗除草剂的作用下能够正常生长和发育，而普通玉米则出现明显的生长抑制现象，说明转基因玉米具有抗除草剂耐受性。
在繁育工作中，转基因抗除草剂耐受玉米可以被用作亲本，与其他优良性状的玉米品种进行杂交，传递抗除草剂耐受基因。
通过反复的杂交、自交和选择，最终获得抗除草剂耐受性和其他优良性状都较好的新玉米品种。
转基因抗除草剂耐受玉米的育种原理主要是基于抗除草剂耐受基因的导入和遗传杂交的选择。
20个玉米种质对除草剂抗性鉴定筛选研究作者：刘挺彭忠华李森林来源：《山地农业生物学报》2020年第02期摘要：对20份玉米种质进行除草剂抗性鉴定表明：不同玉米种质在5叶期喷洒除草剂后的反应不同，具有一定的差异：A16受除草剂影响严重，早期植株枯黄，后期全部死亡;受除草剂影响，A12株高减少20%以上，穗重减少399%，说明该材料对除草剂极为敏感;喷施除草剂不影响自交系A2和A18株高，但显著减少了穗重，说明这两个自交系也易受除草剂影响;A5和A13株高不受除草剂影响，但穗重略有增加;自交系A7、A10和A14喷施除草剂后，株高和穗重略有增加，表现出抗除草剂特性。
关键词：除草剂;玉米种质;抗性;鉴定中图分类号：S513文献标识码：A文章编号：1008-0457（2020）01-0046-04国际DOI编码：10.15958/ki.sdnyswxb.2020.01.007Identification and Screening of Herbicide Resistance of 20 Maize GermplasmsLIU Ting，PENG Zhonghua*，LI Senlin（College of Agricultural，Guizhou University，Guiyang ，Guizhou 550025，China）Abstract：In this study，20 maize germplasms were used to be identified for herbicide resistance The results showed that different maize germplasms had different responses to herbicides after spraying herbicides at the 5￣leaf stage，and there were certain differences in the traits of maize germplasms A16 was significantly affected by herbicides，and the early plants became yellow and finally all of plants died The plant height of A12 was reduced by more than 20% compare with control，and the spike weight of 12 was decreased by 399%，indicating that the material was extremely sensitive to herbicides Spraying herbicides did not affect the plant height of inbred lines A2 and A18，but signifcantly reduced ear weight，indicating that these two inbred lines were also susceptible to herbicides The plant weights of A5 and A13 were not significantly affected by herbicides，but the spike weight increased slightly with the application of herbicides The inbred lines A7，A10 and A14 showed a slight increase in plant height and spike weight of maize germplasms after spraying herbicides，and these showed herbicide resistanceKeywords：herbicide;maize germplasm;resistance;identification玉米是重要的粮食作物，在粮食生产、饲料加工和酿酒业中占有十分重要的地位[1]。
谈谈对转基因技术应用于玉米、大豆等作物的看法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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利用玉米萌动胚获得抗除草剂转基因新材料作者：仲义王云鹏代秀云刘文国来源：《湖北农业科学》2014年第17期摘要：从甲磺隆抗性结缕草植株中克隆得到乙酰乳酸合成酶基因（ALS），构建35S启动子驱动的该基因的植物表达载体p33-ALS。
用农杆菌介导的玉米萌动胚转化方法转化玉米种子，获得抗除草剂的转ALS基因玉米材料。
结果表明，经除草剂筛选共获得抗性植株7株，阳性率为1.4%，T1代植株除草剂抗性试验表明，转基因植株能够耐受住5%的甲磺隆溶液喷洒。
分离得到的ALS基因导入玉米基因组后能够极大地提高对甲磺隆的耐受能力。
关键词：玉米；萌动胚；农杆菌；遗传转化中图分类号：S513；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4001-04Generating Herbicide Resistant Transgenic Plants in Maize withGerminating Embryo as ExplantsZHONG Yi1， WANG Yun-peng2， DAI Xiu-yun1， LIU Wen-guo2（1. Maize Research Institute， Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， Jilin， China； 2. College of Agriculture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）Abstract： The plant expression vector p33-ALS driven by 35S promoter was constructed from the resistance of a short cycling zoysia plants originated from cloning ALS gene. The genetically modified maize with herbicide resistance ALS gene was obtained with agrobacterium mediated transformation of stirring of maize embryo into maize seeds. The results showed that the positive rate of the resistant 7 plants filtrated by way of herbicide was 1.4%. Herbicide resistance of the T1 generation plant showed that the transgenic plants tolerated a solution spray with 5% metsulfuron-methyl. The ALS gene isolated from this study after transferred into maize genome can greatly improve maize tolerance of metsulfuron-methyl.Key words： maize； germinating embryo； agrobacterium tumefaciens； genetic transformation杂草是危害农作物的主要生物胁迫之一，尽管其对玉米生长中后期不再产生影响，但早期仍需要进行除草。
除草剂是玉米除草十分理想的选择，尽管已有玉米专用性除草剂出现，但是对于多数单子叶杂草，其效果仍不理想，并且与草丁膦抗性相关的bar基因、与草甘膦抗性的EPSPS基因等许多除草剂基因均已被国外育种公司注册并取得了专利保护，成为我国育种过程中进一步应用的障碍。
乙酰乳酸合成酶（ALS）是植物和微生物中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸合成途径的第一种酶，不同的ALS的氨基酸序列的差异与磺酰脲类除草剂抗性具有很大的关系，多数植物的ALS对磺酰脲类除草剂较为敏感，目前已在拟南芥、细菌等中对此基因进行了克隆并对氨基酸序列和除草剂抗性的关系进行了研究[1，2]，但相关的专利保护不像bar基因、EPSPS基因那样苛刻。
利用农杆菌侵染及基因枪轰击等方法对玉米不同来源的外植体，诸如悬浮细胞[3]、幼胚[4]、幼穗[5，6]、茎尖[7-9]、成熟胚[10，11]等进行遗传转化。
这些转化方法往往需要消耗大量人力物力并有一定的基因型依赖性。
由于适合进行组织培养的基因型不具备较好的农业性状，因此给进一步的转基因玉米新品种选育工作带来较多阻碍。
利用农杆菌介导玉米萌动胚[12，13]能够较好地解决这一问题，因此适合针对农艺性状好但组织培养体系尚未建立的玉米自交系的遗传转化工作。
本研究利用农杆菌介导方法转化玉米萌动胚的方法将克隆的ALS基因转化到玉米基因组中，分析转基因后对除草剂甲磺隆的抗性，为创建抗除草剂转基因玉米新品种打下基础。
1 材料与方法1.1 试验材料植物材料：JVO16为吉林省农业科学院玉米研究所实验室保存。
结缕草（Zoysia japonica Steud.）种子购自花卉市场。
菌种质粒：质粒pCAMBIA3300、农杆菌EHA105为吉林省农业科学院玉米研究所实验室保存。
试验药品：限制性内切酶、连接酶购自Promega公司，Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi） Taq酶购自北京全式金生物工程公司，胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
200 bp ladder Marker购自加拿大MBI公司。
1.2 试验方法1.2.1 抗甲磺隆ALS基因的获得取1 000粒野生型结缕草种子种植于花盆中，待植株生长至10 cm时喷洒1%甲磺隆溶液。
取存活下来的植株，通过CTAB法提取植物总DNA。
根据NCBI上已知的ALS基因序列设计引物Primer1、Primer2，通过PCR扩增获得ALS基因。
模板用根据已发表的PR10a启动子序列（Genbank AB513331.1）设计的引物扩增。
引物序列为：Primer1：5′-CTCGAGATGGCCACCACCCCGACAAC-3′Primer2：5′-CTCGAGCACTGAAGATATAATCTAAC-3′PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。
PCR产物连入TA克隆载体pEAZY-T1，交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并用DNAMAN和DNASIS软件对其进行序列分析。
1.2.2 植物表达载体的构建用Xho I将pEAZY-ALS上的ALS基因切下，连接到用相同酶切的p3300大片段上，经Xho I酶切验证正确后，命名为p33-ALS。
1.2.3 转化和筛选挑选500粒饱满、无损伤的玉米种子，经0.1%氯化汞浸泡消毒后，加入150 mL无菌水，室温90 r/min振荡12 h。
将吸水膨胀种子进行划胚处理后，加入15 mL OD值为1的农杆菌菌液，共培养48 h。
将共培养后的种子播种在含有蛭石的营养土中，当玉米苗长至三叶一心期时，用0.5%的甲磺隆溶液喷洒筛选。
筛选存活的玉米植株，经PCR检测表现阳性的植株移至大盆，继续生长直至结实。
1.3 PCR检测采用CTAB法提取6叶期除草剂抗性玉米的总DNA，以此为模版进行PCR扩增，检测ALS基因是否插入玉米基因组中。
ALS基因检测用的引物序列如下：Primer3：5′-GGAGTGACGTTGGGGCATC-3′Primer4：5′-ACTCGTGTGACGGCAGGAC-3′预期扩增片段长度为526 bp。
PCR扩增总反应体系为25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix（北京天根生物技术有限公司） 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 nmol/μL），DNA模板1 μL（100 ng/μL），ddH2O 9.5 μL。
PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；之后94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环；最终72 ℃延伸8 min。
试验以未转化植株的DNA为阴性对照，以质粒DNA 为阳性对照，同时设立去离子水为模板的空白对照。
PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 除草剂抗性试验将非转基因玉米和经过PCR检测为阳性的玉米植株后代种植于土壤中，待长至三叶一心期时，用0.5%、1.0%、2.5%、5.0%的甲磺隆溶液喷洒筛选分析除草剂抗性。
2 结果与分析2.1 片段的克隆与序列分析PCR产物经电泳检测，结果表明，成功获得了与目的基因大小相符的约为2 kbp的DNA 片段（图1A）。
片段插入TA克隆载体pEAZY-T1后，命名为pEAZY-ALS。
测序结果表明，PCR扩增所获得的ALS基因序列全长1 938 bp，与报道序列（GenBank accession numberAB513331.1）有34个碱基的差异，同源性为98.6%，所编码的氨基酸有3个位点发生了改变，经与除草剂敏感型水稻、除草剂抗性水稻的ALS蛋白序列进行比较后发现，其中第549位、628位改变与其抗性产生相关，而第55位氨基酸的差异仅为进化中产生的随机突变（图1B）。
与玉米ALS蛋白序列比较结果表明两者之间有88.9%的同源性，而玉米内源的ALS蛋白中第549位、第628位氨基酸与除草剂敏感型水稻一致，属于除草剂敏感型。
为进一步进行遗传转化提高玉米除草剂抗性提供了依据。
2.2 p33-ALS 植物表达载体的构建如图2A所示，通过亚克隆将ALS基因替换p3300上的bar基因。
用XhoⅠ酶切pEAZY-ALS和p3300，分别回收pEAZY-ALS酶切产物中的小片段和p3300酶切产物中的大片段，用T4 DNA连接酶连接转化大肠杆菌。
用XhoⅠ酶切鉴定释放出长约1.98 kbp的片段（图2B），最终经测序证实插入方向正确的重组载体命名为p33-ALS。
2.3 除草剂抗性植株的获得及PCR检测从图3A所示的植物株中经过筛选共计获得抗除草剂玉米植株7株（图3B），经PCR扩增检测的结果如图3C所示，获得的7株抗性植株均为阳性植株，转化率为1.4%。
2.4 除草剂抗性试验经过不同的甲磺隆溶液喷洒1周后，0.5%甲磺隆溶液即可对野生型玉米植株产生影响，由图4可知，野生型植株在用5%甲磺隆溶液喷洒后1周即完全死亡，而T1代PCR阳性的转基因植株几乎完全不受影响。
