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同源重组基因敲除原理引言随着基因工程技术的快速发展，人类对基因编辑和修饰的需求日益增加。
同源重组基因敲除是一种有效的基因编辑技术，可以精确地删除目标基因，进而研究其功能和影响。
本文将从基本原理、步骤以及应用场景等方面详细介绍同源重组基因敲除的原理。
基本原理同源重组基因敲除是一种人工改变生物体基因组的方法。
其基本原理是利用同源重组原理在特定基因位点引入外源DNA序列来替换目标基因或其部分序列。
这个外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因，用于筛选和鉴定敲除细胞。
在同源重组基因敲除中，通常选择目标基因的第一个外显子或关键区域进行敲除，以达到有效丧失目标基因功能的目的。
通过设计特异性的核酸引物，将外源DNA序列与目标基因特定区域相结合，通过同源重组来替代目标基因。
步骤同源重组基因敲除包括以下几个关键步骤：1.设计外源DNA序列：根据目标基因序列，设计与目标基因特定区域同源的外源DNA序列。
外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因。
2.制备敲除载体：将设计好的外源DNA序列插入到敲除载体中。
敲除载体通常是由质粒构建而成，具有选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以方便后续筛选。
3.细胞转染：将敲除载体导入目标细胞内。
转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法和病毒介导转染法等。
转染后，对细胞进行培养和筛选。
4.筛选敲除细胞：根据选择性标记基因的特性，可使用对应的抗生素或其他筛选条件来选择敲除细胞。
只有敲除了目标基因的细胞才能存活下来，形成筛选突变株。
5.鉴定敲除细胞：通过PCR、Southern blot等分子生物学方法对转染细胞进行鉴定。
PCR扩增特定区域并进行测序分析，可确认目标基因是否被成功敲除。
应用场景同源重组基因敲除技术在基因编辑领域具有广泛的应用前景。
以下是该技术在一些应用场景中的具体应用：1.基因功能研究：同源重组基因敲除可以用于研究基因的功能和调控机制。
通过敲除特定基因，观察编辑细胞或生物体的表现差异，从而揭示该基因对生物体的重要性和功能。
![[整理]基因敲除2教学讲义PPT课件](https://uimg.taocdn.com/0ea22bbba98271fe900ef979.webp)
一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统王小利;姜闯;刘建华;刘喜朋【摘要】With the development of functional genomics, gene-knockout is becoming an important tool to elucidate gene functions in vivo. As a good model strain for archaeal genetics, Haloferax volcanii has received more attention. Although several genetic manipulation systems have been developed for some halophilic archaea, it is time-consuming because of the low percentage of positive clones during the second-recombination tion. These classical gene knockout methods are based on DNA recombination between the genomic homologous sequence and the circular suicide plasmid, which carries a pyrE selection marker and two DNA fragments homolo-gous to the upstream and downstream fragments of the target gene. Many wild-type clones are obtained through a reverse recombination between the plasmid and genome in the classic gene knockout method. Therefore, it is neces-sary to develop an efficient gene knockout system to increase the positive clone percentage. Here we report an im-proved gene knockout method using a linear DNA cassette consisting of upstream and downstream homologous fragments, and the pyrE marker. Gene deletions were subsequently detected by colony PCR analysis. We determined the efficiency of our knockout method by deleting the xpb2 gene from the H. volcanii genome, with the percentage of positive clones higher than 50%. Our method provides an efficient geneknockout strategy for halophilic archaea.%随着功能基因组学研究的深入发展，基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除是一种基因编辑技术，用于通过删除特定基因的方法来研究该基因的功能。
该技术依赖于同源重组（homologous recombination）的原理，即通过引入一个与目标基因相似但存在缺陷的DNA片段，使其与目标基因发生交换，从而使目标基因的序列被“剪除”。
同源重组基因敲除的过程可以简单概括为以下几个步骤：
1. 构建敲除基因载体：首先，需要构建一种含有目标基因的缺陷的 DNA 片段的敲除基因载体。
这个载体通常包括两个关键
部分：一个能够与目标基因进行同源重组的“同源臂”，以及一个“筛选标记”以区分带有敲除基因的细胞。
2. 转染细胞：将敲除基因载体导入目标细胞中。
这可以通过多种方法实现，如基因枪、电穿孔或病毒介导等。
3. 同源重组：在目标细胞内，敲除基因载体中的同源臂与目标基因的相应部分发生同源重组，并在此过程中将缺陷的片段插入到目标基因的位置。
4. 筛选转基因细胞：为了筛选那些已经发生同源重组的细胞，通常会在敲除基因载体中加入一个筛选标记，如抗生素的抗性基因。
只有那些发生重组的细胞才能生存下来，因为它们可以在含有相应抗生素的培养基上生长。
通过同源重组基因敲除技术，可以实现有针对性地敲除特定基
因的目的。
这种方法广泛应用于功能基因组学研究，为我们理解基因的功能和相互作用提供了重要的工具。
同源重组基因敲除原理同源重组技术是一种常用的基因编辑方法，它可以通过精确地改变某一特定基因的序列，从而实现对该基因的敲除或修饰。
同源重组基因敲除原理是基于DNA双链断裂修复机制的原理，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
下面我们将详细介绍同源重组基因敲除的原理及其应用。
首先，同源重组基因敲除的原理是基于DNA修复机制的。
在细胞中，DNA双链断裂是一种常见的DNA损伤形式。
细胞会通过两种主要的修复途径来修复这种损伤，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
在同源重组修复过程中，细胞会利用同源DNA片段来修复断裂的DNA，从而实现对目标基因的敲除或修饰。
其次，同源重组基因敲除的实现需要引入外源DNA片段。
这些外源DNA片段通常包含有与目标基因相同或相似的序列，以便在同源重组修复过程中与目标基因发生配对。
一旦发生同源重组，外源DNA片段会替代目标基因的部分或全部序列，从而实现对目标基因的敲除。
同源重组基因敲除技术在基因编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能。
通过敲除特定基因，研究人员可以了解该基因在生物体内的功能及其对生物体的影响，从而揭示基因与生物性状之间的关系。
其次，同源重组基因敲除还可以用于生物工程和生物医学研究。
研究人员可以利用这一技术来改良农作物、动物，甚至进行基因治疗，为人类健康和农业生产提供新的解决方案。
总之，同源重组基因敲除是一种重要的基因编辑技术，它基于DNA修复机制，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
这一技术在基因功能研究、生物工程和生物医学研究等领域有着广泛的应用前景。
随着基因编辑技术的不断发展，同源重组基因敲除技术将为人类社会带来更多的福祉和进步。
基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法基因敲除是一种使特定的基因失活或缺失的技术，它可以用来研究基因的功能和表型。
基因敲除的一种常用方法是利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
然而，这种方法并不总是有效，有时候细胞会利用非同源末端连接机制来修复DNA双链断裂，从而导致不可预测的突变或损伤。
本文将介绍利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法，以及它们的优缺点和影响因素。
同源重组同源重组是一种利用未受伤的姐妹染色单体或者人工提供的供体模板作为修复模板的方式，它可以保持基因组的完整性和稳定性。
同源重组主要发生在S期或G2期，当细胞有两份相同或相似的染色单体时。
同源重组的步骤如下：•首先，细胞需要将双链断裂的末端进行修剪，产生3’单链DNA（ssDNA），这个过程需要MRN复合物（由Rad50、Mre11和Nbs1组成）和转录因子CtIP（CtBP-interacting protein）等蛋白质的参与。
•然后，ssDNA被复制蛋白A（Replication protein A，RPA）包被，使其免受核酸酶的降解，并去除二级结构。
•接着，由BRCA2蛋白介导，RPA被重组酶RAD51替换，形成核蛋白丝寻找姐妹染色单体上或供体模板上的同源序列。
•最后，RAD51蛋白介导侵入DNA双链模板，并与同源DNA序列配对形成D-Loop结构，D-Loop延伸或与另一个末端连接，完成修复过程。
利用同源重组实现基因敲除的方法是设计一个与目标基因有一定同源性但也有一些差异的供体模板，比如在其中插入了一个标记基因或者删除了一个关键片段。
这样，当细胞利用同源重组机制来修复双链断裂时，供体模板会与双链断裂的末端配对，并将修改过的目标基因整合到细胞基因组中，从而达到基因敲除的目的。
利用同源重组实现基因敲除的优点是可以精确地替换或插入目标基因，不会引入额外的突变或缺失。
《基因敲除的原理》基因敲除可以说是基因组学、细胞分离培养以及转基因技术的组合。
那么基因敲除的原理是什么呢？基因敲除的方法有哪些呢？在此，做个小结，以供大家学习。
一.概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法：1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，**证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson**建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中*普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，*常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
基因敲除一、基因敲除简介基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
二、基因敲除的方法及原理1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。
将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。
将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。
其中应用最多的是PNS法。
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
例题(18分）1. 基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：该技术的主要步骤及应用如下：（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。
（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。
同源重组原理的基因敲除同源重组原理是指在相同基因家族中存在有相似的基因序列，在细胞发育或疾病发生过程中，通过交叉互换和基因重组的方式，产生新的基因序列和突变。
同源重组原理的基因敲除是指通过特定方法使某一特定基因失去功能，从而研究该基因在细胞、组织或整个生物体中的作用、功能和调控机制。
同源重组原理的基因敲除方法主要有两种，一种是传统的基因敲除方法，另一种是CRISPR/Cas9系统。
传统的基因敲除方法是通过基因转座，引导同源重组技术来实现基因敲除。
基因转座是指基因序列从一个部位移到其他部位的过程。
以酵母为例，可以构建一个含有基因敲除所需片段的DNA质粒，并通过大量的复制使其进入靶基因的基因座位，然后利用同源重组方式使这个基因座排挤原基因，从而实现基因敲除。
这种方法的优点是简单易行，但存在着一些问题，如基因敲除效率低、通过杂合性培养获取敲除株困难等。
CRISPR/Cas9系统是一种新出现的基因编辑技术，通过修改CRISPR序列和Cas9蛋白使其成为靶向特定基因的工具。
CRISPR序列是一种存在于原核细菌和古细菌基因组中的一段重复序列，与Cas9蛋白一起组成CRISPR/Cas9系统。
Cas9蛋白具有核酸酶活性，可以识别和切割特定的DNA序列。
通过设计合成特异性的CRISPR序列和构建指向目标基因的合适sgRNA（single guide RNA），CRISPR/Cas9系统可以实现高效、准确的基因敲除。
CRISPR/Cas9系统的基因敲除步骤为：首先是设计和合成与目标基因靶向序列相对应的sgRNA，并将其与Cas9蛋白复合；然后将sgRNA和Cas9蛋白复合体导入到细胞中，靶向特定基因的DNA序列；接下来，Cas9蛋白将sgRNA引导到目标基因上，并通过识别和切割目标基因的DNA序列导致其断裂；最后，细胞通过自身修复机制修复断裂的DNA片段，导致错误的连接和缺失，从而使目标基因失去功能。
基因敲除的应用非常广泛。
同源重组基因敲除的流程同源重组基因敲除，这可是个超有趣的基因操作呢。
一、什么是同源重组基因敲除。
简单来说，就是一种对基因进行改造的方法。
我们就像基因世界里的小魔法师，想要去掉某个基因，就会用到这个技术。
想象一下，基因就像一串长长的项链，而我们要敲除的那个基因就是项链上一颗我们不想要的珠子。
通过同源重组的魔法，我们就能精准地把这颗珠子拿掉啦。
这种技术在研究基因功能的时候可太重要了，就好比我们想知道汽车上某个零件有啥用，那就把这个零件拿掉看看汽车会怎么样，对于基因也是同样的道理哦。
二、准备工作。
要进行同源重组基因敲除，那可得好好准备一番呢。
1. 我们得先找到要敲除的目标基因呀。
这就像在一大群小伙伴（众多基因）里找到那个我们想要捉弄（敲除）的特定小伙伴一样。
这个目标基因得是我们已经研究过，知道大概功能或者是我们特别好奇想知道它功能的基因。
2. 构建打靶载体可是个技术活。
这就像是打造一把专门的钥匙，这个钥匙得和我们要敲除的基因所在的那段“基因锁”匹配得严丝合缝。
这个打靶载体通常包含有和目标基因两端同源的序列，这就好比钥匙的齿要和锁孔形状完全一样才能插进去。
3. 细胞的选择也很关键呢。
不同的细胞就像不同的小房子，有些小房子适合做这种基因敲除的实验，有些就不太合适。
我们得选择那些容易接受外来“改造”，而且在培养的时候比较听话的细胞，就像我们要找那些性格好、容易相处的小伙伴一起玩游戏一样。
三、基因敲除的实际操作。
1. 把构建好的打靶载体导入到我们选好的细胞里。
这一步就像是把我们打造好的特殊钥匙送到小房子（细胞）里去开锁。
导入的方法有好多种呢，像电穿孔法，就像是给细胞通了一下电，让细胞开个小缝，好让打靶载体进去；还有脂质体转染法，这就好比给打靶载体穿上一件特制的“小外套”，这个外套能和细胞的细胞膜很友好地融合，然后带着打靶载体就进去细胞啦。
2. 一旦打靶载体进入细胞，同源重组就开始发生了。
这时候细胞内部就像一个小小的战场，打靶载体上的同源序列会找到目标基因，然后进行交换，就像两个战士在交换武器一样。
同源重组技术原理基因敲除⿏技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，⾸次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这⼀技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利⽤这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出⼩⿏（KO Mice: knockout mice）;由于这⼀⼯作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发⽣在姐妹染⾊单体（sister chromatin) 之间或同⼀染⾊体上含有同源序列的DNA分⼦之间或分⼦之内的重新组合。
在基因敲除⼩⿏制作过程中，需要针对⽬的基因两端特异性⽚段设计带有相同⽚段的重组载体，将重组载体导⼊到胚胎⼲细胞后外源的重组载体与胚胎⼲细胞中相同的⽚段会发⽣同源重组，如图1所⽰：制作流程：图2. 基因敲除⿏制作过程⽰意图1、Knockout载体设计与构建根据研究项⽬具体情况和要求把⽬的基因和与细胞内靶基因特异⽚段同源的DNA ⽚段都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。
2、Knockout ES细胞筛选Knockout载体测序验证正确后，将载体线性化，然后电转⼊ES细胞，通过载体上的正负筛选基因获得阳性的Knockout ES克隆。
选取PCR鉴定打靶载体正确插⼊的ES基因组DNA⽤于Southern Blot鉴定，将Southern Blot鉴定的Knockout ES扩⼤培养并液氮保存。
3、Knockout ES细胞囊胚注射得到嵌合体⼩⿏扩增经鉴定插⼊或置换⽚段位置正确的Knockout ES细胞，以囊胚显微注射的⽅式将⼀定数量的Knockout ES细胞注⼊特定品系⼩⿏囊胚中，然后将囊胚移植到假孕的⼩⿏⼦宫中。
