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一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。
2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。
二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。
DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。
本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。
2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。
四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。
（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。
（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。
2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。
（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。
（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。
3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。
（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。
五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。
2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。
3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。
（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
文章编号(A rticle ID ):1009-2137(2009)05-1255-06#论著#健康人骨髓和外周血树突状细胞的分类和计数王东侠,林海荣,王亚哲,常艳,郝乐,刘艳荣北京大学人民医院、血液病研究所,北京100044摘要 本研究应用流式细胞仪采用两种四色抗体组合检测并计数国内健康个体骨髓和外周血树突状细胞DC 亚群。
检测35例健康骨髓中L i n -H LA-DR +CD11c hi BDCA 1+的mDC 和L i n -HLA-DR +CD 123hi BDCA 2+的p DC 数量,并与普遍采用的L i n -HLA-DR +CD11c h i 的mDC 和L i n -HLA-DR +CD123hi pDC 的三色设门方法进行比较。
结果表明:骨髓中DC 亚群的绝对计数和pDC 的相对计数均随年龄的增加而降低;男性DC 亚群的绝对计数值高于女性(p <0.05)。
三色和四色设门方法均显示健康个体骨髓和外周血DC 亚群的分布不同(p <0.05)。
外周血中mDC 含量较高,两种方法检测的mDC 与pDC 的比值分别为2.70和2.31;骨髓与外周血截然不同,骨髓中含有大量pDC ,mDC 与pDC 的比值分别为0.90和0.71。
三色和四色的流式分析方法显示具有很好的相关性(相对计数mDC r =0.86;pDC r =0.96,绝对计数mDC r =0.95;pDC r =0.98)。
两种方法检测的DC 亚群计数除在外周血p DC 检测无明显差异外,外周血中的mDC 和骨髓中mDC 与p DC 计数均明显不同(p <0.001),三色方法确定的值明显高于四色方法,因三色方法确定的mDC 与pDC 中分别存在一定比例的L i n -HLA-DR +CD11c hi BDCA 1-细胞和L i n -HLA-DR +CD123h i BDC A 2d i m /-细胞,在骨髓中这些细胞比例较高。
树突状细胞亚群检测操作程序一、适用范围：外周血或骨髓液中树突状细胞亚群检测。
二、实验原理：人外周血中树突状细胞主要是不成熟DC，有两个亚群，与血液中其它细胞相比，DC细胞有独特的免疫表型。
以此为依据，来检测外周血中树突状细胞的百分含量。
DC1不表达lin（CD19、CD20、CD56、CD14、CD3），高表达HLA-DR 和CD11c；DC2不表达lin（CD19、CD20、CD56、CD14、CD3），高表达HLA-DR和CD123。
利用四色流式细胞仪分析技术，检测出DC1与DC2的百分比。
三、主要试剂：1、Lineage Cocktail-FITC (美国BD Biosciences公司；CAT:340546)，2、Mouse IgG1-PE (美国BD Biosciences公司；CAT:349043)3、Mouse IgG1-APC (美国BD Biosciences公司；CAT:340442)4、CD123-PE(美国BD Biosciences公司；CAT:340545)5、CD11c-APC(美国BD Biosciences公司；CAT:340544)6、HLA-DR-PreCP(美国BD Biosciences公司；CAT:347364)四、实验操作：抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml；或新鲜肝1、标本采集：使用EDTA-K2素抗凝骨髓1.0ml。
2、染色和固定细胞：（1）标本管编号A，另取流式专用试管两只AT(测定)、AC（对照）。
（2） AT管加入Lineage Cocktail-FITC、HLA-DR-PreCP、CD123-PE、CD11c-APC各20ul。
AC管加入Lineage Cocktail-FITC、HLA-DR-PreCP、Mouse IgG1-PE和Mouse IgG1-APC各20ul。
（3） AT、AC管中加入全血或骨髓100ul，混均。
（4）置室温，避光孵育15min。
流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析CD123+（抗IL-3受体α链）和CD11c+树突状细胞亚群概述树突状细胞（DC）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递。
其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞。
但是，与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女T细胞（Naive T cell）。
DC细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。
由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以DC细胞的研究非常困难。
因此，关于DC细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究。
这些过程利用了DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。
但是，这些方法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力。
而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析。
最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞表面CD83和CMRF-44高表达。
CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。
在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3Rα在淋巴器官的DC细胞上有特异表达。
从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC细胞。
IL-3Rα（CD123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+ DC细胞进行200倍富集。
CD123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD123+ DC。
在外周血中也有CD123+ DC细胞，与以前所说的CD11c- DC细胞和CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞。
由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一类细胞。
流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析CD123+（抗IL-3受体α链）和CD11c+树突状细胞亚群概述树突状细胞（DC）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递。
其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞。
但是，与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女T细胞（Naive T cell）。
DC细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。
由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以DC细胞的研究非常困难。
因此，关于DC细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究。
这些过程利用了DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。
但是，这些方法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力。
而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析。
最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞表面CD83和CMRF-44高表达。
CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。
在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3Rα在淋巴器官的DC细胞上有特异表达。
从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC细胞。
IL-3Rα（CD123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+ DC细胞进行200倍富集。
CD123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD123+ DC。
在外周血中也有CD123+ DC细胞，与以前所说的CD11c- DC细胞和CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞。
由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一类细胞。
DC细胞既可以由成熟的外周血单核细胞生成，也可以由未分离的CD34+干祖细胞经GM-CSF和TNF-α培养得到。
使用CD123抗体，发现有一群CD34+ DC 样幼稚细胞。
这群细胞与CD34+干祖细胞的区别是可以发育成Langerhan细胞样DC。
因此，根据CD123强染，可以识别出一类人类DC细胞，它是不同组织间DC细胞的连接桥梁。
在外周淋巴组织中还发现另一个DC亚群，与CD123+ DC不同的是，其表型为CD11c+HLA-DR+LINdim/-。
与CD123+ DC相反，这群DC细胞位于生发中心。
在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/- DC细胞，与CD33brightCD14dimCD16- DC细胞是同一类细胞。
由此可见，DC系统由多种细胞类型构成，发育途径不一。
但是，目前对这些细胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理条件下如何受调控等方面仍缺乏了解。
CD123+ DC和CD11c+ DC细胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它们可能有不同的功能。
近年来的研究主要集中在使用DC细胞进行抗肿瘤和抗感染治疗方面。
不同报道证实，这有可能抑制肿瘤生长。
使用这些新的DC标记物建立起来的检测系统，可以帮助对新鲜外周血新鲜中的两类不同的DC细胞进行定量检测，同时可以加以分离。
实验方法采用三色或四色流式细胞仪分析，检测速度快，样本用量少，可以用来辅助研究在病理和生理条件下，DC在免疫调控中作用。
检测原理和用具检测原理：本实验目的是从外周血中检测两种类型的DC细胞：CD123+ DC （Anti-IL-3Rα+）和CD11c+ DC。
CD11c和CD123并不是DC特异的标志物。
两类细胞均HLA-DR高表达，单核细胞、淋巴细胞和NK细胞的系列标记物弱表达。
因此使用单一荧光标记的LIN cocktail（LIN1）抗体将DC细胞区分出来。
LIN1抗体包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。
另外，本实验还可以区分嗜碱粒细胞。
嗜碱粒细胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。
使用HLA-DR可以区分嗜碱粒细胞和CD123+ DC细胞。
细胞来源：样本使用EDTA、ACD或肝素钠抗凝全血，或分离的外周血单个核细胞（PBMC）。
样本采集后24小时内检测。
试剂：1.检测DC细胞用的BDIS荧光标记的单克隆抗体。
四色分析：LIN1 FITC：货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56 CD123 PE（Anti-IL-3Rα）：货号340545Anti-HLA-DR PerCP：货号347364CD11c APC：货号340544Mouse IgG1 PE：货号349043Mouse IgG2a APC：货号340473三色分析：LIN1 FITC：货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56 CD123 PE（Anti-IL-3Rα）：货号340545CD11c PE：货号347637Anti-HLA-DR PerCP：货号347364Mouse IgG1 PE：货号349043Mouse IgG2a PE：货号3490532.FACS Lysing Solution（10X）：FACS溶血素，货号349202，用去离子水1：10稀释3.洗液：PBS缓冲液4.1X PBS配制的1%多聚甲醛设备用具：1.EDTA、ACD或肝素钠真空采血管2.12⨯75mm FALCON试管3.振荡混匀器4.FACS流式细胞仪5.离心机6.微量加样器全血样本荧光抗体染色步骤：1.按照下表在各管中加入适量抗体；FITC PE PerCP APC4-Color 四色分析Tube 1 LIN1 20uL CD123 5u（全血）Anti-HLA-DR 10uL CD11c 5uLTube 2 LIN1 20uL10uL（PBMC）Mouse IgG1 Anti-HLA-DR 10uL Mouse IgG2a3-Color 三色分析Tube 1Tube 2 Tube 3 Tube 4 LIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLCD123 5uL（全血）10uL（PBMC）Mouse IgG1CD11c 5uLMouse IgG2aAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL2.每管加入100uL全血，振荡混匀，室温暗处反应15分钟；3.加入2mL FACS溶血剂，振荡混匀，室温暗处放置10分钟；4.300xg离心5分钟，弃上清；5.振荡混匀，加入1mL洗液；6.300xg离心5分钟，弃上清；7.振荡混匀，加入300uL 1%多聚甲醛；8.2-8︒C暗处保存，24小时内上机分析PBMC样本荧光抗体染色步骤：1.按照上表在各管中加入适量抗体；2.每管加入50uL全血，振荡混匀，暗处冰浴反应25分钟；3.轻轻混匀，加入1mL洗液；4.300xg离心5分钟，弃上清；5.轻轻混匀，加入300uL 1%多聚甲醛；6.2-8︒C暗处保存，24小时内上机分析数据获取：1.使用CaliBRITE微球，做FACSComp，调整PMT电压和荧光补偿，检查仪器灵敏度；2.上样：使用CELLQuest软件，获取50,000个细胞，用FSC设阈值，排除碎片干扰；3.使用CELLQuest软件分析结果数据分析：1.区分细胞和碎片：使用FSC/SSC点图，画R1，排除碎片和死细胞；2.找到LIN1弱阳性和阴性群体：使用Anti-HLA-DR/LIN1点图（G1=R1），画R2，圈定LIN1弱阳性和阴性细胞；3.区分外周血DC和嗜碱粒细胞：在四色分析中，管1区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2是同型对照。
在三色分析中，管1和管3区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2和管4是同型对照。
使用同型对照区分非特异染色在Gate List中定义G3=R1 AND R2。
使用Anti-HLA-DR/CD123点图和Anti-HLA-DR/CD11c点图（G3=R1 AND R2），图中只显示LIN1弱阳性和阴性细胞。
画R3，圈定嗜碱粒细胞（Anti-HLA-DR-/CD123+）；画R4，圈定CD123+ DC细胞（Anti-HLA-DR+/CD123+）；画R5，圈定CD11c+细胞（Anti-HLA-DR+/CD11c+）；4.在Gate List中定义各门：G4（嗜碱粒细胞）=R1 AND R2 AND R3，G5（CD123+ DC）=R1 AND R2 AND R4，G6（CD11c+ DC）=R1 AND R2 AND R5，G7=R1 AND R2 AND（R3 OR R4 OR R5）；5.确认细胞群的准确性：下图显示了四色分析全血样本时的CD123+ DC、CD11c+ DC和嗜碱粒细胞各群的位置。
6.分析各群细胞的百分含量：点击Anti-HLA-DR/LIN1（G1=R1）点图，做统计，得到各群细胞所占比例∙CD123+ DC% R1 AND R2 AND R4∙CD11c+ DC% R1 AND R2 AND R5∙嗜碱粒细胞% R1 AND R2 AND R3在三色分析时，由两个点图分别得到统计结果。
CD11c+ DC%由CD11c PE 点图得到，CD123+ DC%和嗜碱粒细胞%由CD123 PE点图得到。
分析结果：在外周血中，DC含量很低，因此，在流式细胞分析中，需要获取50,000个细胞。
下表总结了各细胞亚群的表型特征。
