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Ultimate 3000型高效液相色谱仪自主操作培训教材福州大学测试中心2018年9月第一部分Ultimate 3000型高效液相色谱原理和仪器配置一、液相色谱原理简介1、色谱法起源色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
2、液相色谱法的分离原理溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
英文为High Performance Liquid Chromatography，简称为HPLC。
3、HPLC分离模式包括反相模式 (RP-LC)；正相模式 (NP-LC)；离子对色谱 (IPC)；离子交换色谱 (IEC)；体积排阻色谱 (GPC/GFC)；亲和色谱（AC）等。
其中，反相和正相模式又属于液液分配色谱。
•流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。
正相与反相的出峰顺序相反；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
C-18柱（常用反相柱）。
4、HPLC与经典液相色谱方法以及气相色谱（GC）方法的比较4.1 HPLC与经典液相色谱方法比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。
可以在数分钟内完成数百种物质的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。
U-3000液相色谱使用手册之三Chromeleon 中文版U-3000样品表的建立2012.TMO戴安产品培训中心.★服务热线：800-810-5118, 400-650-5118★客服邮箱：★市场培训：0(电话) 0 (传真)(邮箱)目录说明 (3)一．色谱仪器控制区(Console) (4)二．建立一个仪器方法 (5)1．采集时间和采集通道设置 (5)2．LPG-3400SD泵常规设置 (6)3．泵流速梯度的设定 (6)4．WPS-3000自动进样器的常规设置 (7)5．进样模式 (8)6．TCC-3100柱温箱常规设置 (10)7．UV(DAD-3000RS)紫外二极管阵列检测器通道设定 (12)8．新建立仪器方法的预览与修改 (13)9．保存新建并修改过的仪器方法 (15)三．创建一个处理方法 (16) (18)202021 4．输入待测样品个数225. 输入每个待测样品进样次数 (22)6．设置自动进样器开始位置 (22)7．输入待测样品进样体积 (22)8．建好待测样品表 (23)9．为新建序列指定所用方法和报告 (23)10．保存新建序列表 (23)六、修改样品序列表 (25)1. 修改样品名称 (25)2．修改样品类型 (25)3．修改样品瓶位置 (27)4．修改进样体积 (27)5．选择所用仪器方法 (27)6．选择所用处理方法 (28)7．状态 (28)8．样品重量 (28)9．稀释因子 (28)10．内标量 (28)11．保存经修改后的样品序列表 (28)说明利用液相色谱来分析一批样品，一般需要五个文件来完成。
1、需要一个控制面板（e panel）控制面板是实验人员通过计算机与仪器交流的直接界面。
而且在通讯连接正常时，仪器的所有参数都在面板上反应并被记录。
2、需要一个仪器方法(Instrument Method)规定测定这些样品时所用到的系统的条件：比如泵的流速，压力上下限；自动进样器/手动进样阀的进样持续时间；检测器波长；柱温箱的温度；测每个样品需要的时间等等。
变色龙光谱库功能使用技巧分享姓名：刘奕麟单位：昆明市食品药品检验研究院地址：昆明市气象路60号邮编：650032从事分析检测工作以来，使用并对比过不少厂家的色谱数据软件，其中变色龙系统以其操作简单、界面友好、扩展丰富的特点一直被我和同事们视为色谱数据处理最得力的助手。
除了日常的数据分析功能，我们发现变色龙软件还具备强大的光谱库功能，通过自建光谱库，可以轻松实现①未知物的自动筛查、②色谱峰表自动匹配等多项功能，为提高日常工作效率带来诸多便利，下面我就结合实例进行简单的分享。
一、光谱库的快速建立1、首先将需要加入光谱库的图谱进行准确定位和积分，并在色谱峰表中对各个色谱峰进行注：该图谱必须使用二极管阵列检测器采集，并在仪器方法中开启3D图谱采集功能。
2、然后点击选中任一已命名的色谱峰，点击上方选项卡（红色方框处），显示对应色谱峰的紫外吸收光谱图；。
3、然后点击“光谱图”，激活窗口上方光谱图对应的选项卡，点击“光谱库”（Library），在图示下拉菜单中选择“建立新光谱库”（Create new library），在弹出窗口中输入光谱库名称并保存。
4、点击“增加光谱”（Add Spectrum）右侧下拉箭头，选择“新增所有光谱图”（Add AllSpectra），所有已命名的色谱峰对应的光谱图即可全部加入光谱库中。
5、点击Studio界面左侧【光谱库】，即可浏览所有已经添加的光谱库，每个光谱自动以对应的色谱峰名称命名，点击每个光谱图，屏幕下方会自动显示光谱信息和最大吸收值。
二、光谱库的关联要使用已建好的光谱库，可将光谱库文件拷贝至目标序列中，然后在处理方法的【光谱库筛选】（UV Spectrum Library Screening）选项卡中，加入光谱库文件进行关联（同一样品序列可以关联多个光谱库文件），窗口右侧为光谱匹配方式和阈值，可以根据实际筛查情况进行调整。
三、光谱库的使用1、未知物的自动筛查：1.1 点击激活图谱中的未知色谱峰，然后点击报告编辑器（选择“默认DAD”模板）。
大连依利特P230p高效液相色谱系统操作规程1. 系统组成：本系统由P230p高压恒流泵、UV230II紫外-可见检测器、Rheodyne 7725i手动进样阀、Rheodyne 3725i手动进样阀、Rheodyne 7000L手动切换阀、W3200色谱工作站/计算机以及打印机组成。
2. 程序：(使用分析型系统时，切换阀需朝下且制备进样阀需在LOAD位置）（使用制备型系统时，切换阀需朝上且分析进样阀需在LOAD位置，并且需要更换制备型检测池）2.1准备2.1.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（色谱纯；必须用0.45 μm滤膜过滤）、配制样品和标准品（必须用0.45 μm滤膜过滤）、选择合适色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）、与进样阀配套的进样器。
2.1.2通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
2.2开机和泵操作2.2.1开机。
接通电源，依次打开P230p泵、UV230II检测器，待仪器自检结束显示正常状态后，打开计算机显示器和主机。
2.2.2更换溶剂及排气泡。
2.2.2.1打开P230p泵后，确定P230p泵是停止运行的，同时系统实际压力为0时，打开放空阀(逆时针转动放空阀手柄至180度)；2.2.2.2将一小烧杯放在放空阀出口管下以收集流出的流动相；2.2.2.3按冲洗键使泵用最大流量对流动相进行更换，也可使用配件中的20 mL吸液针管连接到放空阀出口管处进行抽取，确保FEP输液管及熔剂过滤头没有气泡；2.2.2.4如沉子有污染，则抽取溶剂过程中会有大量的气泡出现；2.2.2.5流动相更换完毕后关闭冲洗键，再将放空阀顺时针拧紧，这样泵前管路的流动相更换完毕；2.2.2.6运行P230p泵，更换系统其它部分流动相（进样阀，色谱柱及检测器）；注：进样阀处于INJECT 位置，更换定量管中的流动相2.2.2.7待基线走平后，系统流动相基本彻底更换；2.2.3打开工作站。
戴安高效液相色谱仪产品配置来源：南京途威仪器设备有限公司免费热线：4008-585-600优谱佳UHPLC+高效液相色谱系统• UHPLC+设计理念贯穿纳升液相、常规液相和快速液相整个范围• 基础型和标准分析型系统的最大压力创立了高效液相的新标准—620bar • 双三元液相系统—为常规分析设计，增加产率并拓展色谱分析技术应用范围• 变色龙色谱软件—智能化、专业化、人性化• Viper和nanoViper接头系统—可手动安装拆卸，适应超快速液相范围并保证零死体积。
RSLCnano系统• 提供20 nL/min到50 μL/min的纳升/毛细管/微升流速范围• 柱最高耐压可达800bar• 连续直流输送• 上样泵可提供从10 μL/min到2.5 mL/min的流速RSLC系统• 二元或四元系统都可用于超快速液相和常规液相的应用• 更广的压力—流速范围兼容超快速、超高分离度的分析应用• 系统最高耐压1000bar• 可提供高效双三元RSLC系统标准分析型系统• 为常规液相应用提供最佳性能和可靠性• 620bar耐压和100Hz的数据采集频率均兼容超快速液相应用• 可根据不同应用灵活配置• 最高流速可达10mL/min，满足全方位应用需求基础型系统• 满足常规应用需求且更加耐用• 分析结果一致可靠• 提供620bar耐压和高达100Hz数据采集频率，全面兼容UHPLC应用• 自动进样器与柱温箱整合，可提供样品和色谱柱温控功能检测器选项• 提供多种光学检测器选择－紫外/可见，荧光和示差折光检测器• 创新型Corona通用电喷雾式检测器• 高灵敏度库仑电化学检测器• 支持AB、布鲁克和赛默飞质谱检测器软件与备件• 变色龙软件—直观的仪器控制，先进的数据处理• D-Library数据库提供应用搜索支持• Viper与nanoViper手旋接头系统，真正零死体积，简化安装拆卸过程• 色谱柱加工制造—包括整体柱技术和先进的多基质键合技术UltiMate® 3000 RSLCnano 系统目前，RSLCnano系统研发的重点是提高样品通量。
分析型液相色谱系统全二维液相色谱分离技术及应用前言赛默飞液相色谱特色技术——双三元（DGLC ）梯度分离技术众所周知，全二维液相色谱分离技术峰容量大、动态范围宽、分辨率高，具有更好的分离能力。
因此，在利用液相色谱对复杂样品的化学组成及其含量进行分析时，基于各种接口技术结合正交分离模式的全二维液相色谱分离技术，可获得更好更多的结果，尤其是分析时间不受限制的离线全二维分离模式，在获得更高峰容量的同时兼具应用灵活的特点。
2D-LC 的峰容量 (n) = n1x n2整合进样、分离、切换、收集，并完成二维或多维自动化分离分析是色谱分析仪器的发展趋势，赛默飞世尔科技早在Ultimate Famos Switchos 微流液相系统上就实现了多维模式的分离分析，2006年就在Ultimate3000 nano and Cap 系统上配置Comprehensive 2D LC kits 实现了全二维分析，现在将在线、离线全二维分析进一步推广在常规分析型液相系统上以满足日益增长的各种分析需求。
赛默飞能将在线、离线全二维分析推广在常规分析型液相系统上正是得益于独特的双三元（DGLC ）梯度分离技术。
该技术采用双泵设计，每个泵作为一个单独的体系，有各自独立的比例阀和流动相体系，同时单独控制三种不同的流动相，在Chromeleon 变色龙软件的支持下，结合独特的阀切换技术，通过灵活的流路连接设计，使一套常规分析型液相色谱系统即可以轻松实现二维及全二维液相色谱分离。
此外该技术还可轻松实现在线固相萃取、流动相在线除盐、在线柱后衍生和反梯度补偿、并联/串联色谱等高级应用。
值得一提的是该技术不仅可应用于常规液相，而且还AValve126543BValve126543二维液相色谱分离原理引自: Giddings, J. Chromatogr. A, 703 (1995), 3n 2p e a k sn 1peaks3在线全二维分离技术应用实例中药刺五加刺五加（Acanthopanax senticosus ）是五加科五加属的一种落叶灌木，主要的药用部分是它的根及根皮，药材名又称五加参，是中药五加皮的一种。
高效液相色谱仪操作规程1目的制定高效液相色谱仪的标准操作规程，减少误操作，使其规范化，保证检验电子数据的完整性，可追溯性及安全性。
2适用范围本规程适用于高效液相色谱仪的使用与管理。
3组成3.1Chromeleon数据库基于局域网的色谱类仪器控制和色谱数据处理，提供具有访问控制和审计跟踪功能的安全数据存储，通过对数据文件执行版本控制，可以确保数据的完整性、可追溯性和安全性。
3.2局域网组成1)液相色谱仪：泵、进样器、柱温箱、检测器等组件。
2)ECD服务器：数据的存储与备份，3)PC客户端：人机连接端。
4)控制器：连接服务器、高效液相色谱仪及PC端。
5)Chromeleon:是一款可升级的，功能全面的色谱工作站。
软件分三个部分，左下角为类别栏，包含仪器，数据，固定的工作流程；左上角为导航栏，此处对应显示类别栏选中后的相关信息；右侧为工作区。
上侧为菜单栏。
4程序4.1开机4.1.1开机前准备1)流动相的配制：根据待检样品的检验方法准备所需的流动相（应足够；流动相必须用至少0.45um滤膜过滤；流动相必须充分脱气，流动相配制所用的有机相必须是色谱级的，所用的水必须是双重蒸馏水。
）2)样品的处理：称取或量取适量的对照品或供试品、用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成份）进行充分溶解（或超声溶解），根据检测结果再适当调节溶液浓度，样品应过滤（0.45um有机膜或水膜）3)更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）。
4)请确认：清洗泵头密封圈的10%异丙醇或甲醇水溶液是否走空，是否清洁，洗针通道或洗针液瓶没有走空。
5)依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源。
4.1.2Chromeleon登陆与液相连接1)登录PC客户端：输入用户和密码登陆PC客户端。
2)登录Chromeleon：双击变色龙图标，进入Chromeleon7界面，输入账号和密码，登陆Chromeleon工作站。
3)连接控制器：关闭仪器控制，变色龙图标显示为，表示客户端链接断开。
Ultimate3000双三元液相系统并联应用中进样干扰问题解决方案之三刘绿叶 金燕赛默飞世尔科技（中国）有限公司引言Ultimate3000双三元液相色谱系统有多种应用模式，可做串联，并联，在线富集，二维色谱等，可以提高分析效率，增强自动化，减少工作量，扩展应用范围。
系统采用独特的双泵设计，每个泵作为一个独立的体系，有各自的比例阀和三通道流动相体系，可通过Thermo Scientific Dionex Chromeleon 变色龙软件完美控制。
其中并联应用旨在通过共享自动进样器和柱温箱，基于阀切换技术实现在U3000双三元液相系统上同时运行两个不同的分析方法，作为两套独立系统使用，配置及连接方式，可参照应用中心提供的《双三元并联应用指南》。
成功的应用例子如环境水样中的痕量爆炸物（硝基化合物）的测定[1]。
因美国环保署（US EPA ）要求用两根柱子做爆炸物的测定，为了排除假阳性，只有两根柱子同时检出，才能确认是阳性。
这样就需要同时有两套液相系统同时测定，或者在一套系统上先后使用两根色谱柱进行测定，耗时，耗力，耗财。
使用Ultimate 3000双三元液相色谱并联应用则可完美解决这个问题，节约一半时间或成本。
但是我们在做并联应用时发现，两个系统同时独立运行时，一边系统的进样行为会对另一边系统的基线造成扰动。
主要表现在两个方面：1） 进样时阀切换会造成两边压力波动，压力波动会表现在低波长检测的色谱图上。
产生原因是由于两边使用的色谱柱和流动相均不一样，因此，两边系统存在压力。
2）由于共用了自动进样器及连接管路，因此，一边系统进样后残留在管路里的流动相，势必影响到另一边系统里的分析方法。
解决办法：1）把关键词双三元系液相系统，并联，干扰问题解决目标解决Thermo Scientific TM Dionex TM UltiMate TM 3000 双三元高效液相色谱系统并联应用中，当一个流路系统进样时，对另一流路系统造成的干扰问题。
在线二维液相色谱法快速测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量使用双梯度液相色谱系统和紫外检测器，建立在线二维液相色谱方法，同时测定桂枝茯苓胶囊中芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的含量。
采用双梯度液相色谱的其中一个泵为一维分离泵，以乙腈为有机相，0.08%磷酸+0.08%三乙胺为水相，梯度洗脱，采用C18色谱柱（3.0 mm×150 mm，3 μm），流速0.5 mL·min-1；利用双梯度液相色谱的另外一个泵为二维分离泵，以乙腈为有机相，以20 mmol，pH 3.0的磷酸二氢钾为水相，梯度洗脱，采用PAⅡC18色谱柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），流速0.8 mL·min-1；检测波长218，230，275 nm，采用波长切换方式。
芍药苷、丹皮酚、苦杏仁苷和肉桂酸的线性范围分别为5.55～222，6.6～264，3.3～132，0.315～12.6 mg·L-1；r分别为0.999 7，0.999 5，0.999 8，0.999 7；4个成分的平均回收率在96.12%～103.9%。
该方法快速，测定结果准确可靠，可用于评价药物质量。
标签：二维液相色谱；双梯度液相色谱；桂枝茯苓胶囊；苦杏仁苷；肉桂酸高效液相色谱已成为中药复杂体系研究的重要技术，随着新型色谱柱填料和键合技术的发展，为中药中各类成分的分离提供了多种选择，然而中药的复杂性已远远超出了人们的设想，Davis等[1]曾经指出用一维分离方法对含有100个随机组分的样品进行分离，完全分离82个组分，至少需要400万的理论板数，且当色谱峰的数量超过峰容量的37%时，系统的分离度会大大降低，所以在现有技术条件下，期望如此高的柱效和峰容量是不切实际的。
多维液相色谱分离是液相色谱发展的一个重要方向，它是将多种不同分离机制的色谱体系进行联用，增加了色谱系统的分离能力，扩大了分离空间，提高了系统的峰容量，可以满足复杂样品的分离要求。
智能液相色谱解决方案（四）变色龙7.1体系下双三元液相色谱在线样品处理应用指南1.综述在色谱分析方法中，获得一致且准确的分析结果，样品前处理过程，如溶解，稀释，过滤等，是必不可少的。
对于基质简单的样品（如合成化学品），则样品处理过程比较简单，操作方便，耗时短。
但对于基质复杂的样品（如土壤、生物发酵液、天然产物），则前处理过程会很复杂(如粉碎、提取、富集、液液萃取等)，操作繁琐，耗时长，存在安全隐患，因此不利于日常分析工作。
对于复杂样品前处理，U3000液相色谱可提供完美的整体解决方案。
当U3000液相色谱具有如下配置，则可以进行在线样品处理●双三元梯度泵(DGP-3600)●自动进样器（WPS-3000 SL/TSL）●柱温箱（TCC-3000），配置有2位-6孔(2-position-6-port)或2位-10孔(2-position-10-port)柱切换阀●一根富集（或纯化）小柱●一根分析柱●一台检测器（DAD,FLD,CAD,MSD）同传统离线手工样品处理技术相比较，在线样品处理解决方案具有如下特点：可以引入大体积的未经处理的样品溶液（如血浆，尿液，发酵液，环境水等）自动对样品进行纯化或富集痕量组分，无需投入过多人力，可长时间自动运行（如过夜连续操作）避免人工操作所带来的误差，方法重复性好，结果准确耗时短，操作简便，成本低，工作效率高最大程度降低人员操作所带来的危害和风险2.在线样品处理步骤在线自动样品处理过程包括三个过程（如图1所示）：1、样品组分由进样器与左泵流动相引入到富集（或纯化）上进行富集（或纯化），干扰物（或基质）则从柱上流出并排至废液收集器，分析柱处于清洗与平衡的过程(Sample.Fraction)，2、目标组分由富集（或纯化）柱上转移至分析柱的过程(Transfer/Separation)，3、目标组分在分析柱上定性（或定量）分析，富集（或纯化）柱则进行离线清洗和平衡的过程(Separation)在线样品处理方法开发过程中，正确设置阀的切换时间对分析效果有着重要影响。
通常要设置：1、组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2），2、基质流出时间（t M ），3、阀第一次切换时间（t V1），4、组分转移时间（t T ），5、第二次阀切换时间（t V2）、6、分析条件第一步：确定组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）（如图2所示）：方法：将富集柱与检测器（如UV ）直接连接（切换阀位于1-2连接）。
将组分标准品（浓度接近样品组分浓度，如果富集柱峰形可能比较差，为了便于观察出峰位置，建议适当地浓图2 确定组分洗脱时间时的仪器连接图及洗脱时间示意图图1 在线样品处理过程示意图部件名称：1双三元梯度泵(Dual-Gradient Pump)，2自动进样器(Autosampler)，3富集（或纯化）柱(SPEcolumn)，4分析柱(Analytical column)，5检测器(Detector)，6柱切换阀(Valve)度大一些）由进样器引入至富集柱，观察组分在检测器形成的信号响应，直至基线恢复初始状态，记住组分的起始时间t A1和组分的截止时间t A2，调节左泵流动相条件，使组分在富集柱上有所保留（建议t A1>5min）。
第二步：确定基质流出时间（t M）(如图3所示):图3 确定基质流出时间时的仪器连接图及基质流出时间示意图方法：将富集柱与检测器（如UV）直接连接（切换阀位于1-2连接），左泵流动相条件与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将样品由进样器引入至富集柱，由检测器上观测基线情况，记住当基质流出后基线基本恢复到初始状态时（此时目标组分仍保留在富集柱上，要求t A1> t M时）的时间点t M，t M为基质流出时间。
第三步：验证组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）和基质流出时间（t M）(如图4所示):图4 验证组分洗脱时间时的仪器连接图及基质流出时间、组分洗脱时间示意图方法：将富集柱与检测器（如UV）直接连接（切换阀位于1-2连接），左泵流动相条件与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将加标的样品（加标浓度最好与第一步中确定组分洗脱时间时的标准品一致）由进样器引入至富集柱，由检测器上观测基线情况，如上图所示，记住组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）和基质流出时间（t M），一般情况下基质流出时间（t M）不会变化，组分洗脱时间（起始时间t A1和截止时间t A2）会有所变化，要求t A1> t M。
第四步：确定阀第一次切换时间（t V1）：方法：设置第一次切换时间（t V1），使t A1> t V1> t M。
第五步：确定组分转移时间（t T）（如图5所示）：图5确定组分转移时间时的仪器连接图及转移时间示意图方法：将切换阀1位置直接与检测器连接（切换阀最初位于1-2连接）。
左泵流动相条件与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将标准品溶液通过进样器引入至富集柱上，在阀第一次切换时间（t V1）时通过软件将柱切换阀由1-2连接转换为1-6连接，调节右泵流动相条件，观察标准品由富集柱转移出来并经检测器得到响应信号，直至标准品组分完全流出，记住检测器基线恢复至初始状态时的时间点为样品转移时间（t T）。
在调节右泵流动相条件的过程中，每次需要再次进样时，需要手动到控制面板的柱温箱模块里将柱切换阀由1-6连接转换为1-2连接且自动进样器改为“进样(Inject)”状态，然后使用初始左右泵流动相条件平衡富集柱5分钟后才能再次进样。
第六步：验证转移时间（t T）（如图5所示）：方法：将切换阀1位置与检测器直接连接（切换阀最初位于1-2连接）。
左泵流动相条件与最终确定的组分洗脱时间方法中保持一致，将加标的样品（加标浓度最好与第一步中最终确定的组分洗脱时间方法时的标准品一致）溶液通过进样器引入至富集柱上，在阀第一次切换时间（t V1）时将柱切换阀由1-2连接转换为1-6连接，使用第五步确定组分转移时间的最终右泵流动相条件，观察组分由富集柱转移出来并经检测器得到响应信号，直至组分完全流出，记住检测器基线回复至初始状态时的时间点为组分转移时间（t T）。
要求第六步的组分转移时间（t T）与第五步的组分转移时间（t T）保持一致。
然后手动将柱切换阀由1-6连接转换为1-2连接且自动进样器改为“进样(Inject)”状态，使用初始左右泵流动相条件平衡富集柱5分钟之后，再将未加标样品溶液通过进样器引入至富集柱上，重复上述动作，观察加标样品里组分出峰位置，应该没有组分峰的出现。
第七步：确定第二次阀切换时间（t V2）：方法：设置第二次切换时间（t V2），使t V2> t T。
第八步：确定分析条件（连接如图6所示所示）：方法：将富集柱及分析柱按照正常的online SPE连接方式连接后，在第二次阀切换时间（t V2）后调节右泵的流动相条件，确定最终的分析条件。
而在阀第二次切图6 确定分析条件时的仪器连接图及转移时间示意图换时间（t V2）之后，富集柱是用左泵进行离线清洗和为下次进样而进行的平衡过程。
3.使用变色龙7.1版本建立在线样品处理方法步骤基于上述各时间点的信息，运用变色龙(Chromeleon 7.1)色谱管理软件建立的online SPE 方法整个过程如图7所示：图7 Online SPE方法过程示意图下面案例中将介绍在变色龙(Chromeleon , Ver.7.1, SR1)色谱管理软件方法建立过程。
首先，在配置模块(Server Configuration)里确保柱温箱已配置有切换阀（2位-6孔或2位-10孔），如图8所示：图8 配置模块(Server Configuration)所在位置在打开配置模块后，选择相应的色谱系统（Instrument）中柱温箱部件，在工具栏上选择“编辑(Edit)”下的“属性(Properties)”选项（或右键单击选择该选项）。
本例中选择Demo 系统，并右键单击选择“属性”，如图9所示：图9色谱系统（Instrument）中柱温箱配置在柱温箱“属性”窗口中，选择“部件(component)”栏，根据仪器实际配置（左部或右部）选择相应的柱切换阀和安装的两根色谱柱（富集柱和分析柱）。
本例中选择右部安装2位-6孔(2-position-6-port valve)和柱A和B，如图10所示：图10柱温箱阀配置上述设置完成后，保存设置并退出配置模块。
打开变色龙软件，点击菜单栏中“创建(Create)”下的“仪器方法(Instrument method)”，如图11所示：图11仪器方法(Instrument method)的建立所在位置在出现的窗口中，选择相应的色谱系统。
本例中选择Demo系统，如图12所示：图12 选择相应的仪器系统点击“下一步(next)”，进行相应色谱配置（如图13所示），选择相应的运行时间(Run Time)以及不同的通道(Channel)。
图13 选择相应的仪器系统点击“下一步(Next)”，进行上样泵（左泵(PumpLeft)）的设置，输入流动相的基本信息，如图14所示：图14 上样泵（左泵(PumpLeft)）的流动相基本信息继续点击“下一步(Next)”，进行上样泵（左泵(PumpLeft)）流动相梯度设置，如图15所示：图15 上样泵（左泵(PumpLeft)）流动相梯度设置本例中设置左泵上样时流动相为90%A及10%B，流速为1ml/min，样品进入富集柱后在接下来的4分钟内进行富集（或纯化）及转移至分析柱，4分钟后对富集柱进行冲洗和平衡。
输入具体的流动相梯度后后，继续点击“下一步”，进行分析泵（右泵(PumpRight)）的设置，输入流动相的基本信息，如图16所示：图16分析泵（右泵(PumpRight)）的流动相基本信息继续点击“下一步(Next)”，进行分析泵（右泵(PumpRight)）流动相梯度设置，如图17所示：本例中设置右泵分析时，流动相A 在11分钟内由10%升至90%，然后再平衡至10%的初始状态，流速为1ml/min ，最初的4分钟是组分的富集和转移过程，4分钟之前，分析柱在右泵初始流动相条件下进行平衡，4分钟之后，切换阀位于1-2位连接，右泵开始梯度进一步分离并对目标组分进行定性（或定量）分析，分析结束后进行清洗和平衡。
输入具体的流动相梯度后后，继续点击“下一步”，对自动进样器的参数进行设置，如图18所示：图18 自动进样器的参数设置-1图17分析泵（右泵(PumpRight)）流动相梯度设置继续点击“下一步(Next)”，如图19所示，选择与自动进样器连接（也就是与富集柱连接）的泵：继续点击“下一步(Next)”，如果“自动进样器(Sampler)”是带控温功能，需要选择是否启动“控温功能（Use Temperature Control ）”及控温的范围（如图20所示）：图20 控温功能的自动进样器的参数设置图19 自动进样器的参数设置-2继续点击“下一步(Next)”，设置柱温箱的基本信息（如图21所示）：图21 柱温箱的基本信息的设置继续点击“下一步(Next)”，设置左右泵相应的色谱柱（如图22所示），本案例选择富集柱A连接左泵，分析柱B连接右泵，左泵用于样品富集（或纯化），右泵用于在线分析，切换阀位于柱温箱右侧，当柱切换阀处于1-2位相连时，样品由自动进样器引入至富集柱上进行富集，分析柱则处于清洗和平衡过程，如图6连接所示图22设置左右泵相应的色谱柱点击“下一步(next)”，在“柱温箱(Column Oven)”模块下（如图23所示），分别在每一步里按照要求输入第一次阀切换时间（t V1）和第二次阀切换时间（t V2）。
