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实验五基因结构预测分析
目的：
1、熟悉并掌握从基因组核酸序列中发现基因的方法。
内容：
1、用NCBI的ORF Finder分析原核生物核酸序列或真核生物的cDNA序列中的开放阅读框；
2、使用GENSCAN在线软件预测真核生物基因；
3、使用POL YAH在线预测转录终止信号；
4、使用PromoterScan在线预测启动子区域。
操作及问题：
随着测序技术的不断发展，越来越多的模式生物启动了全基因组测序计划，完成全基因组测序的物种也越来越多，使得基因结构和功能的预测成为可能。同时，通过基因组文库筛选也可得到目的基因所在克隆。获得克隆序列后，同样也需要对目的基因做结构预测以便指导后续功能研究。本实验介绍几种常用的基因预测分析工具，预测核酸序列的开放阅读框、转录终止信号、启动子、CpG岛等信息。
一、开放阅读框（open reading frame，ORF）的识别
ORF是指从核酸序列上5’端翻译起始密码子到终止密码子的蛋白质编码序列。原核生物与真核生物的基因结构存在很大不同，真核生物的ORF除外显子（平均150bp）外，还含有内含子，因此真核生物基因的预测远比原核生物复杂。
（一）利用NCBI ORF Finder预测原核生物核酸序列或真核生物的cDNA序列中的开放阅读框。/gorf/gorf.html
1、在NCBI上查找AC 号为AE008569 的核酸记录。（见实验五中的AE008569.mht）
问题1：这个序列的名称？
问题2：这个序列来源物种所属的生物学大分类？
2、进入OFR Finder，首先在页面下方的Genetic codes下拉菜单中浏览现有的22 种遗传密码选择项（这里我们只使用默认的standard code），利用AC 号或其ra w sequence（即不带任何注释信息的全序列）进行ORF finding。（预测结果见实验五文件夹中AE008569 ORF Finder.mht）
3、在结果显示页面中，按照序列的正向+1、+2、+3 以及反向的1、2、3 进行的六框翻译结果以图形的方式显示在页面中。利用默认的100bp阈值所发现的各框内的ORF以绿色条状显示。同时，按照六框内所有发现的ORF 的大小顺序，在页面的右侧有一个列表，分别显示了ORF 的翻译框在核酸序列上的位置以及ORF 的长度。你可以改变ORF 鉴别中的长度阈值（50，100，300），点击Redraw 重新进行计算。
4、点击图形上的绿色条框，就可以对这个ORF 进行检查（当然也可以点击右侧的ORF 列表），页面上会显示预测的氨基酸序列，同时页面上还嵌入了BLAST 程序以及NCBI 的有关序列数据库以便于发现与此ORF 相似的库记录。
5、SixFrames 是以另外一种方法计算并显示结果，点击SixFrames，结果中各框上边拉下的绿色短线表示为一个起始密码子，而各框下方的粉色短线表示为一个终止密码子。
6、如果你拥有一个高等生物的cDNA 时，可以利用ORF finder 这个简单的工具来找到你的蛋白编码区域。因为cDNA 不含有intron，因此可拥有与微生物相似的ORF 结构。
根据以上预测结果回答问题3：
问题3：该条序列中最长的ORF是多长？编码多少氨基酸？位于序列中的什么位置？
（二）使用GENSCAN在线软件预测真核生物基因
GENSCAN（/GENSCAN.html）软件由斯坦福大学的Chris Burge开发，它是针对基因组DNA序列预测ORF及基因结构信息的开放式在线资源，尤其适用于脊椎动物、拟南芥和玉米等真核生物。
这里以提交一个AC号为AC002390的人类cosmid序列为例，进入GENSCAN 页面，先选择物种脊椎动物（vertebrate），上传序列文件或直接粘贴序列，运行后，
从返回结果中可获得所预测到的基因数目、外显子数目和类型，预测单元的长度、方向、位置及相位、编码区打分值、可信概率、总的分值等信息。（结果见实验五文件夹中AC002390 GENSCAN Output.htm）根据结果回答问题：
问题4：经预测，该序列中可能有几个基因？是否完整？
问题5：预测到的第一个基因的编码区由几个外显子组成？起始外显子的位置在什么区域？
二、CpG岛的预测分析
CpG岛（CgG island）是指一段200bp或更长的DNA序列，核苷酸G+C的含量较高，并且CpG双核苷酸出现频率占G+C含量的50%以上，其中“P”表示“C”和“G”以磷酸二酯键连接。有60％～80％的人类基因的启动子和起始外显子附近存在CpG岛，因此搜寻cpG岛可以为基因及其启动子预测提供重要线索。
这里介绍CpGPlot这个EMBL-EBI中心开发的网上在线预测CpG岛工具。
我们仍以上述AC002390这个人类cosmid序列作为CpGPlot的预测对象。进入CpGPlot页面（/emboss/cpgplot/index.html），上传序列文件或直接粘贴序列并采用默认参数，完成提交任务。（结果见实验五文件夹AC002390 CpGPlot.mht文件）
运行（Run）后，CpGPlot将以CpGplotPNG格式返回3个图示结果：①序列各个位置（G+C）含量观察值/期望值（Obs/Exp）的比率；②序列各个位置的（G+C）％；
③CpG出现频率高于阈值的位置。同时以Cpgplot output输出文本，告知提交序列AC002390全长70311，各个位置（G+C）含量Obs/Exp比率>0.60，（G+C）％>50.0；两个CpG岛长度及起始、终止位置。
问题6：在该序列中预测到几个CpG岛？分别位于序列的什么区域？
参照GENSCAN的预测结果发现，前一个CpG岛位置正好和基因起始外显子区域对应；而后一个CpG岛出现在启动子区域上游2 kb左右的区域，并没有基因对应
